2009-02-06
org.kosen.entty.User@7c6fb973
유은혜(blueeh1004)
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특정 단백질의 cell 내 localization을 보려고 합니다.
fixation 부터 해서 immuno staining을 하고 형광 현미경을 관찰 하였는데
제가 처음 혼자 해보는 거라 실험 과정에 있어 주의할 점이 많을 것 같은데 자세한
정보를 얻기가 어렵네요.
예를 들면, fixation solution을 fresh한 걸 써야 한다던지...등등.
HeLa cell로 실험을 한번 해보았는데요. 현미경 관찰시 세포가 원래의 모양대로 보이지 않고 동글 동글 해 보이더라구요.어느 step에서 이상이 있었는지 알고 싶구요.
그밖에 주의해야할 부분들 좀 가르쳐 주셨으면 합니다.
참고로 DAPI stain도 할 거구요.
mounting 약 10ul정도 슬라이드에 떨어뜨리고 커버글라스를 덮는데 꾸욱 누를 때 미끄러져 버리는데 노하우 좀 가르쳐주세요.
제가 완젼 실험 초보라 많이 가르쳐주셨으면 감사하겠습니다.
- confocal
- fixation
- immunocytochemistry
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
김은민님의 답변
2009-02-09- 0
일단 세포가 동글동글 해졌다는 것은 4% paraform aldehyde가 pH가 맞지 않다던지.. 세포가 즐거워하지 않는 컨디션이기 때문일것으로 추정됩니다. 일단 fixation buffer는 되도록이면 fresh하게 만들어주시는 것이 좋습니다. IC를 할 때 필요한 용액들은 반드시 미리 준비해두시고, 진행하는 것이 좋습니다. 그리고 washing할때 세포가 떨어져 나가지 않도록 한 방향에서 wash 용액을 흘려주는 것이 좋습니다. 형광을 관찰하는 것이기 때문에, 한 sample은 반드시 secondary antibody 만을 binding 시켜 background를 인지하셔야하구요. mounting solution은 형광을 유지시켜주는 solution으로 하는 것이 좋습니다. 그리고 mounting시 미끄러지는 것은 당연하오니, 미끄러지더래도 bubble이 안들어가는 것이 더욱 중요하오니, 손가락과 손목의 스냅을 이용하세요~(꾸준히 연습해야한답니다.) 건승을 빕니다. >특정 단백질의 cell 내 localization을 보려고 합니다. >fixation 부터 해서 immuno staining을 하고 형광 현미경을 관찰 하였는데 >제가 처음 혼자 해보는 거라 실험 과정에 있어 주의할 점이 많을 것 같은데 자세한 >정보를 얻기가 어렵네요. >예를 들면, fixation solution을 fresh한 걸 써야 한다던지...등등. >HeLa cell로 실험을 한번 해보았는데요. 현미경 관찰시 세포가 원래의 모양대로 보이지 않고 동글 동글 해 보이더라구요.어느 step에서 이상이 있었는지 알고 싶구요. >그밖에 주의해야할 부분들 좀 가르쳐 주셨으면 합니다. >참고로 DAPI stain도 할 거구요. >mounting 약 10ul정도 슬라이드에 떨어뜨리고 커버글라스를 덮는데 꾸욱 누를 때 미끄러져 버리는데 노하우 좀 가르쳐주세요. >제가 완젼 실험 초보라 많이 가르쳐주셨으면 감사하겠습니다. >