2009-02-13
org.kosen.entty.User@938d9a8
고은혜(nabool)
- 2
당단백질들을 정제 하다가 분석결과에 의문이 생겨 문의드립니다.
여러 고수님들의 고견 부탁드립니다. ^^;;
==========================================================================
glyosyation된 단백질을 1M NaCl이 포함된 버퍼로 gradients를 주어
양이온크로마토그래피로 정제(파장 280nm로 세팅)하였습니다.
버퍼 pH는 4.0이었으며,
resin은 SP sepharose(동일과학)를 사용하였습니다.
NaCl 농도 구배에 따라
Rf값이 큰 차이를 보이는
분리된 두 개의 피크로 나눠진 데이터를 얻었습니다만,
SDS-PAGE 결과, 이 두개의 피크가 모두 target으로 분석되었습니다.
만약, 단백질 분자들 간에 glycosylation된 양상이 다르다면,
(당사슬 개수 차이, glycosylation된 당의 종류가 다른 경우 등등..)
또한, 이들 당 사슬이
이온크로마토그래피에 사용된 resin의 binding에 영향을 준다면,
단백질 분자들이 resin에 binding될 때
resin에 대한ㄴ 각 단백질 분자들 간에
상대적인 결합력의 차이를 초래하게 되어
이온크로마토그래피 상 두개의 피크로 분리된 것이라 추측하고 있었습니다.
그런데,
이 두 피크의 fraction을
C8 컬럼을 사용하여 파장 280nm에서 HPLC로 분석해 보니
같은 Rf값을 보입니다.
(즉, 같은 elution time에 target 피크가 나옵니다.)
사용된 이동상은,
A : 0.1% TFA가 포함된 증류수
B : 0.1% TFA가 포함된 ACN 입니다.
HPLC의 경우,
C8 컬럼에서는 glycosylation에 따라 차이가 없는 것인지,
혹은, HPLC 컬럼 분석 시 사용된 이동상의 pH 범위(pH 2 이하)에서는
glycosylation에 따른 단백질 분자간의 elution 차이가 없어지는 것인지,
아니면,
양이온크로마토그래피 결과에서 가정한 것들에 오류가 있었던 것인지....
궁금합니다.
==========================================================================
많은 조언 부탁드립니다.
읽어주셔서 감사합니다. ^^
- glycoprotein
- protein purification
- HPLC analysis
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
-
답변
이상후님의 답변
2009-02-13- 0
>당단백질들을 정제 하다가 분석결과에 의문이 생겨 문의드립니다. >여러 고수님들의 고견 부탁드립니다. ^^;; > >========================================================================== >glyosyation된 단백질을 1M NaCl이 포함된 버퍼로 gradients를 주어 >양이온크로마토그래피로 정제(파장 280nm로 세팅)하였습니다. >버퍼 pH는 4.0이었으며, >resin은 SP sepharose(동일과학)를 사용하였습니다. > >NaCl 농도 구배에 따라 >Rf값이 큰 차이를 보이는 >분리된 두 개의 피크로 나눠진 데이터를 얻었습니다만, >SDS-PAGE 결과, 이 두개의 피크가 모두 target으로 분석되었습니다. > >만약, 단백질 분자들 간에 glycosylation된 양상이 다르다면, >(당사슬 개수 차이, glycosylation된 당의 종류가 다른 경우 등등..) >또한, 이들 당 사슬이 >이온크로마토그래피에 사용된 resin의 binding에 영향을 준다면, >단백질 분자들이 resin에 binding될 때 >resin에 대한ㄴ 각 단백질 분자들 간에 >상대적인 결합력의 차이를 초래하게 되어 >이온크로마토그래피 상 두개의 피크로 분리된 것이라 추측하고 있었습니다. > >그런데, >이 두 피크의 fraction을 >C8 컬럼을 사용하여 파장 280nm에서 HPLC로 분석해 보니 >같은 Rf값을 보입니다. >(즉, 같은 elution time에 target 피크가 나옵니다.) >사용된 이동상은, >A : 0.1% TFA가 포함된 증류수 >B : 0.1% TFA가 포함된 ACN 입니다. > >HPLC의 경우, >C8 컬럼에서는 glycosylation에 따라 차이가 없는 것인지, >혹은, HPLC 컬럼 분석 시 사용된 이동상의 pH 범위(pH 2 이하)에서는 >glycosylation에 따른 단백질 분자간의 elution 차이가 없어지는 것인지, >아니면, >양이온크로마토그래피 결과에서 가정한 것들에 오류가 있었던 것인지.... >궁금합니다. >========================================================================== > >많은 조언 부탁드립니다. >읽어주셔서 감사합니다. ^^ 이온크로마토그래피 용출에서는 종종 sample loading양에 따라서 같은 물질임에도 불구하고 다른 retentiontime에 나올때가 있습니다. 농도 구배가 컬럼안에서 diffusion되면서 약간의 시간차이에 따라 갖은 ionic strength를 갖는 시료들이 다른 시간차이를 두고 용출되는 현상이 일어나기도 합니다. 만약 이것이 원인이 아니라면, HPLC 컬럼을 C8을 사용하지 말고 amine 컬럼을 사용해 보시기 바랍니다. amine 컬럼상에서도 같은 retention time을 보이면 같은 시료일 확률이 높습니다. -
답변
신재욱님의 답변
2009-02-13- 0
질문자님이 정제하신 것이 순수한 당단백질이라는 가정하에(불순단백질이 포함되지 않은...) 당단백질이라면 gycosylation말단에 sialic acid가 붙어져 있습니다. 당단백질 정제시 sialic acid함량에 따라서 단백질의 정제의 pH, 염농도 구배에 의해 분리/정제 되어질 수 있습니다. 일반적으로 당단백질인 경우는 sialic acid함량이 생체내 활성의 영향을 미칠 확률이 높기 때문에 일정 수준 이상의 sialic acid함량을 가진 당단백질만을 정제하는 경우가 많습니다. 따라서 sialic acid가 일정함량 이상으로 존재하는 당단백질을 정제하는 것은 이온교환크로마토그래피에서 가능하며 이러한 차이로 인하여 정제한 당단백질을 분석하기 위해서는 RP-HPLC나 SDS-PAGE로는 확인하시기 어렵습니다. 분석시 하나의 peak와 하나의 band로 나올 것입니다. Sialic acid는 워낙 분자량이 적어 분자량 차이를 보일 정도로 band 차이가 나는 것도 아니고 RP처럼 분리능이 나올 수 있을 만큼 영향을 미치지 않기 때문이죠. Sialic acid의 차이를 확인하시기 위해서는 일단 IEF band를 확인하시고 후에 두 물질이 같은지를 확인하시기 위해 IEF-Western을 하시면 됩니다. 두 물질이 같다고 확인되고 sialic acid함량을 확인하고 싶으시다면 Bio-LC를 사용하여 sialic acid정량을 하시면 됩니다. 또한 Glycosylation pattern을 보실려면 peptide mapping을 하셔야 하며 효소로는 Trypsin(TPCK treated)와 Glu-C를 사용하셔야 확인하실 수 있습니다. 단순한 reverse phase로는 확인하시기 어렵습니다. 일반적으로 peptide mapping이 아니면 HPAEC-PAD방법을 이용하셔서 분석하셔야 합니다.