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지식나눔

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cloning troubleshooting 좀 부탁드립니다.

2009-02-19 org.kosen.entty.User@3f501cb 오용식(rockeryosi)
  • 1
제가 library를 만들고자 cloning을 시도중인데요, 다른 부분은 잘 되는것 같은데 제한효소 처리한 vector의 CIAP 처리에 문제가 있는지 transformation을 해보면 colony가 관찰되지 않아요;; 나름 troubleshooting을 해보고자 control을 positive와 negative를 설정하고, 제한효소 처리한 vector에 CIAP 처리한것과 처리하지 않은 것을 각각 ligation 해보았는데 (self-ligation이라도 되나 싶은 마음에...) CIAP 처리하지 않은 것은 self-ligation되어 colony가 관찰되는 반면에 CIAP 처리한것은 colony가 관찰되지 않네요... 이렇게 되면 CIAP 처리에 확실히 문제가 있는것 같은데... CIAP 처리는 사용하는 제조사 information을 따라 진행을 하고 있고요, 혹시나 CIAP가 오래되서 그러나 싶은 마음에 해로 구입해서 사용해보았는데 똑같은 문제점이 나타나네요... 도대체 왜 그런것인지.. 도움 좀 주셨으면합니다... 부탁드립니다..
  • cloning
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답변 1
  • 답변

    서기원님의 답변

    2009-02-19
    • 0
    제가 클로닝에 많은 지식이 있는것은 아니지만 CIAP는 보통 5'의 인은 가수분해 해서 벡터의 self ligation을 보호하기 위한 일입니다.. 선생님께서 하신 검정 실험의 CIAP처리 그룹에서 self ligation이 관찰되지 않는것은 당연한 결과인것 같네요.. 전반적인 실험 내용이나 실험 결과들을 제가 알수 없기 때문에 문제 해결할 만한 답은 드릴수 없지만 양쪽 끝에 동일한 제한효소를 사용하는 경우나 blant end가 아니라면 CIAP를 처리하지 않고도 일반적으로는 클로닝이 됨니다.. 하지 않아도 되는 실험 스텝은 가능한한 줄이시는게 실험 성공 확률도 높이고 실험이 않됐을때도 덜 복잡해지겠죠.. 그래도 몇가지 고려 사항이라도 말씀드리면 1. 경험상 클로닝은 제한효소에서의 문제가 제일 큽니다.. vector의 경우 잘 잘리지 않거나 한쪽만 잘리는 경우 많습니다. 특히 한쪽만 잘리는 경우 양쪽이 잘리는 것과 구분이 안서니깐요. 또한 insert DNA의 경우도 만약 다른 벡터에 있는것을 잘라 사용하는것이 아니라 PCR product를 그대로 이용할 경우 잘 잘리는지 구분이 안섭니다.(PCR productdml 이용시 보통은 이런 경우를 방지하기 위해.. primer에 해당 제한 효소가 잘 인식하는 것으로 알려지 side DNA를 몇개 더 넣어 줍니다. 2. 위의 제한 효소의 문제가 아니라면 compitent cell의 efficiency가 실험자가 생각하는 곳보다 낮을 경우도 있음니다.. 좋은 효과를 가지는 컴셀을 다시 만들던지 여유가 있다면 회사에서 파는 컴셀을 사는 경우도 좋은 방법 임다. 3. ligantion의 문제.. 이런경우는 드뭄니다.. control 실험 한번 하면 해결되구요. 4. 이도 저도 문제가 없는데 그냥 단순히 클로닝이 안된다면 가장 최악의 경우인데. 그냥 계속 해보는 방법밖에 없슴다. 무식한 방법이지만 몸으로 때우는 거지요. 그냥 왜 그런지는 알수 없지만 잘 안되는 경우 있슴다.. 저희 실험실도 동일 조건으로 하면 다른것은 다 되는데 특정 유전자만 안되는 경우 종종 있습니다.; 그래서 어떤 연구원들은 몇달동안 죽어라 반복하며 속 많이 태웁니다. 좋은 결과 얻으세요..
    답변수정
    제가 클로닝에 많은 지식이 있는것은 아니지만 CIAP는 보통 5'의 인은 가수분해 해서 벡터의 self ligation을 보호하기 위한 일입니다.. 선생님께서 하신 검정 실험의 CIAP처리 그룹에서 self ligation이 관찰되지 않는것은 당연한 결과인것 같네요.. 전반적인 실험 내용이나 실험 결과들을 제가 알수 없기 때문에 문제 해결할 만한 답은 드릴수 없지만 양쪽 끝에 동일한 제한효소를 사용하는 경우나 blant end가 아니라면 CIAP를 처리하지 않고도 일반적으로는 클로닝이 됨니다.. 하지 않아도 되는 실험 스텝은 가능한한 줄이시는게 실험 성공 확률도 높이고 실험이 않됐을때도 덜 복잡해지겠죠.. 그래도 몇가지 고려 사항이라도 말씀드리면 1. 경험상 클로닝은 제한효소에서의 문제가 제일 큽니다.. vector의 경우 잘 잘리지 않거나 한쪽만 잘리는 경우 많습니다. 특히 한쪽만 잘리는 경우 양쪽이 잘리는 것과 구분이 안서니깐요. 또한 insert DNA의 경우도 만약 다른 벡터에 있는것을 잘라 사용하는것이 아니라 PCR product를 그대로 이용할 경우 잘 잘리는지 구분이 안섭니다.(PCR productdml 이용시 보통은 이런 경우를 방지하기 위해.. primer에 해당 제한 효소가 잘 인식하는 것으로 알려지 side DNA를 몇개 더 넣어 줍니다. 2. 위의 제한 효소의 문제가 아니라면 compitent cell의 efficiency가 실험자가 생각하는 곳보다 낮을 경우도 있음니다.. 좋은 효과를 가지는 컴셀을 다시 만들던지 여유가 있다면 회사에서 파는 컴셀을 사는 경우도 좋은 방법 임다. 3. ligantion의 문제.. 이런경우는 드뭄니다.. control 실험 한번 하면 해결되구요. 4. 이도 저도 문제가 없는데 그냥 단순히 클로닝이 안된다면 가장 최악의 경우인데. 그냥 계속 해보는 방법밖에 없슴다. 무식한 방법이지만 몸으로 때우는 거지요. 그냥 왜 그런지는 알수 없지만 잘 안되는 경우 있슴다.. 저희 실험실도 동일 조건으로 하면 다른것은 다 되는데 특정 유전자만 안되는 경우 종종 있습니다.; 그래서 어떤 연구원들은 몇달동안 죽어라 반복하며 속 많이 태웁니다. 좋은 결과 얻으세요..
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