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지식나눔

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DNA ligation 실패이유?

2009-03-17 org.kosen.entty.User@4efe9a5b 이예나(bonobono0127)
  • 4
생화학을 전공하고 있는 학생입니다 PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 자꾸 실패를 해서요.. 1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. 어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요?
  • DNA
  • ligation
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답변 4
  • 답변

    김성미님의 답변

    2009-03-18
    • 0
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? one cut으로 ligation을 하면 self-ligation이 잘되어서 좀 어렵습니다. 계속한다고 해도 vector의 self-ligation, DNA의 self-ligation으로 힘듭니다 차라리 각기 다른 enzyme site로 primer를 다시 합성하는 것이 더 빠를 듯이 생각됩니다. 저도 오랫동안 ligation을 했지만 one cut으로는 왠만해선 안합니다. 뒷쪽에 XhoI, Sal I등 맞는 site를 찾아서 primer 재합성을 강추합니다. 요즘 primer 값도 싸잖아요^^;;;
    답변수정
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? one cut으로 ligation을 하면 self-ligation이 잘되어서 좀 어렵습니다. 계속한다고 해도 vector의 self-ligation, DNA의 self-ligation으로 힘듭니다 차라리 각기 다른 enzyme site로 primer를 다시 합성하는 것이 더 빠를 듯이 생각됩니다. 저도 오랫동안 ligation을 했지만 one cut으로는 왠만해선 안합니다. 뒷쪽에 XhoI, Sal I등 맞는 site를 찾아서 primer 재합성을 강추합니다. 요즘 primer 값도 싸잖아요^^;;;
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  • 답변

    오용식님의 답변

    2009-03-25
    • 0
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? 2 cut으로 바꾸어 실험하는 것을 추천하고 싶으나 굳이 1 cut으로 실험을 하셔야 한다면... 기존에 어떠한 방법으로 하고 계시는지는 모르나.. 한번 ligase의 unit을 줄이시고 반응을 4도씨에서 overnight하여 해보시는것이 어떨까요..?? 이상 허접한 답변이었습니다..^^;;
    답변수정
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? 2 cut으로 바꾸어 실험하는 것을 추천하고 싶으나 굳이 1 cut으로 실험을 하셔야 한다면... 기존에 어떠한 방법으로 하고 계시는지는 모르나.. 한번 ligase의 unit을 줄이시고 반응을 4도씨에서 overnight하여 해보시는것이 어떨까요..?? 이상 허접한 답변이었습니다..^^;;
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  • 답변

    한상수님의 답변

    2009-03-30
    • 0
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? 흠.. 1cut ligation이라고 해서 달리 안되고 그런건 없습니다. 우선 ligation 반응에서 가장중요한건 DNA purity라서 우선 vector와 insert의 purity를 먼저 check 해보시길 권장하고요. 추천하는 방법은 ethanol precipitation을 수행하여 purity를 높이시기바랍니다. 그다음 ligation buffer check해보시고요..DDT나 ATP의 분해정도를... 그다음 마지막으로 중요하게 생각하셔야 할것이 DNA Mol 비 입니다. 보통 vector:insert 비율을 1:3이나 1:5로 사용하시는데요.. insert의 비율을 늘려가지고 넣어보시는건 어떠신지요? 이부분을 어느정도 check하신다면 원하시는 실험이 가능할꺼라고 생각이 드네요..
    답변수정
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? 흠.. 1cut ligation이라고 해서 달리 안되고 그런건 없습니다. 우선 ligation 반응에서 가장중요한건 DNA purity라서 우선 vector와 insert의 purity를 먼저 check 해보시길 권장하고요. 추천하는 방법은 ethanol precipitation을 수행하여 purity를 높이시기바랍니다. 그다음 ligation buffer check해보시고요..DDT나 ATP의 분해정도를... 그다음 마지막으로 중요하게 생각하셔야 할것이 DNA Mol 비 입니다. 보통 vector:insert 비율을 1:3이나 1:5로 사용하시는데요.. insert의 비율을 늘려가지고 넣어보시는건 어떠신지요? 이부분을 어느정도 check하신다면 원하시는 실험이 가능할꺼라고 생각이 드네요..
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    DELETED님의 답변

    2010-01-05
    • 0
    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? >Re: 먼저 근본적으로, PCR product를 cloning할때는 primer design시 enzyme site를 붙일때 flankin seq를 붙여줘야 합니다. 만약 site만 넣어서 제작하였다면 cloning하기 쉽지 않습니다. 잘 잘리지 않으니까요..
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    >생화학을 전공하고 있는 학생입니다 > >PCR product를 가지고 bamH1처리후 ligation을 하는데 >자꾸 실패를 해서요.. >1cut이라 cip처리하는 번거로움도 있고 한데 >처음부터 제한효소 자리를 한가지로만 만들어서 .. > >어떻게하면 ligation에 성공할수 있을까요? >Re: 먼저 근본적으로, PCR product를 cloning할때는 primer design시 enzyme site를 붙일때 flankin seq를 붙여줘야 합니다. 만약 site만 넣어서 제작하였다면 cloning하기 쉽지 않습니다. 잘 잘리지 않으니까요..
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