2009-03-21
org.kosen.entty.User@45dfb36
최연재(bpmedic)
- 4
TA cloning 후 E.coli(3kb)을 가지고 transformation하여 plasmid prep을하였습니다. 1%agarose gel 에 loading하여 밴드를 관찰해보았더니.. 약3.5kb정도 (3~4kb사이)에서 밴드를 확인하였습니다.. 제가 TA cloning한 DNA가 350bp길이의 것이여서 확실히 transformation이 되었다고 생각하고 ECoR1으로 제한효소처리 하여 vector에 제대로 insert되었는지 확인할려고 전기영동했는데... 이런! plasmid prep한것보다도 위쪽 3.8kb정도에 밴드가 관찰 되었습니다... 이런 이상한 일이 벌어졌습니다.. 도와주세요 insert가 안된건지...아님 다른걸로 제한효소 처리를 해야는지.. 도와주세요
- transformation
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 4
-
답변
정복기님의 답변
2009-03-23- 0
전기영동시에 circular form보다 linear form이 더 빨리 내려갑니다. 제 생각으로는 circular form이 었던 plasmid가 enzyme 처리 후 linear form이 되어 더 위에서 band가 형성되었을 수도 있다봅니다. 하지만 3kb이었던 vector가 3.8kb에서 걸린다는 것을 뭐라 설명하기가... Insert의 정확한 염기서열을 알고 계신다면 sequencing을 하여 보시는 것은 어떠하실는지요? -
답변
장성재님의 답변
2009-03-23- 0
클로닝 후에는 반드시 시퀀싱을 통해서 정확한 염기서열인지의 여부를 확인하시는 것이 좋습니다. 또한, 플라스미드는 일반적으로 supercoiled 형태이므로, insert를 확인할 때에는 반드시 제한효소로 절단하여 linear 형태로 만든 후 사이즈를 확인하시는 것이 좋습니다. 일반적으로 사용하는 DNA size marker의 경우도 lamda phage를 HindII로 절단하여 만든 것이므로 linear form입니다. >TA cloning 후 E.coli(3kb)을 가지고 transformation하여 plasmid prep을하였습니다. 1%agarose gel 에 loading하여 밴드를 관찰해보았더니.. 약3.5kb정도 (3~4kb사이)에서 밴드를 확인하였습니다.. 제가 TA cloning한 DNA가 350bp길이의 것이여서 확실히 transformation이 되었다고 생각하고 ECoR1으로 제한효소처리 하여 vector에 제대로 insert되었는지 확인할려고 전기영동했는데... 이런! plasmid prep한것보다도 위쪽 3.8kb정도에 밴드가 관찰 되었습니다... 이런 이상한 일이 벌어졌습니다.. 도와주세요 insert가 안된건지...아님 다른걸로 제한효소 처리를 해야는지.. 도와주세요 -
답변
오용식님의 답변
2009-03-25- 0
혹시라도 도움을 줄 수 있을까 싶어 답변을 남기려 했는데... 질문이 조금 이상해서... 한가지 여쭙고자 합니다 ^^;; TA cloning 후 E.coli(3kb)을 가지고 transformation하여 plasmid prep을하였습니다. -> 이게 무슨 말이죠? E.coli (3kb) 이게 정확히 무엇을 말하시는건지;; 사용한 TA cloning kit의 vector 크기는 어느정도인가요? 보통 2.9 - 3 kbp를 쓰는것으로 알고 있는데 이건 제품마다 다르므로 사용한 제품의 information을 확인해보세요 제가 알기로는 제품마다 제한효소의 위치나 종류가 틀린것으로 알고 있습니다. 한번쯤 확인해보시는것도 도움이 될 듯 싶네요.. -
답변
DELETED님의 답변
2010-01-05- 0
>TA cloning 후 E.coli(3kb)을 가지고 transformation하여 plasmid prep을하였습니다. 1%agarose gel 에 loading하여 밴드를 관찰해보았더니.. 약3.5kb정도 (3~4kb사이)에서 밴드를 확인하였습니다.. 제가 TA cloning한 DNA가 350bp길이의 것이여서 확실히 transformation이 되었다고 생각하고 ECoR1으로 제한효소처리 하여 vector에 제대로 insert되었는지 확인할려고 전기영동했는데... 이런! plasmid prep한것보다도 위쪽 3.8kb정도에 밴드가 관찰 되었습니다... 이런 이상한 일이 벌어졌습니다.. 도와주세요 insert가 안된건지...아님 다른걸로 제한효소 처리를 해야는지.. 도와주세요 >Re: 다른 enzyme으로도 잘라서 mapping 부터 해보시고 그게 아니라면, clonig를 다시 하심이 맞는 것 같네요..