2009-03-26
org.kosen.entty.User@1a2ef774
이병수(kannylee)
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고수님들께 도움받고자 올립니다.
제가 클론닝을 해서 현재 단백질 발현을 시키는중입니다.
하지만 발현정도가 보이지않아서 고심하고 있는데요
일단 많이들 알고 계시는 클로닝은 넘어가겠습니다
(PCR-> T-vector cloning 후 sequencing 확인까지)
insert(800bp)- T vector 까지는 이상이 없습니다.
enzyme site 또한 이상이 없고요
expression vector는 PET-22b 이고요
사용된 enzyme site 는 NdeI BamHI 입니다.
잘라서서.. insert 없는 vector control 걸고 size 확인까지.. 했고요
vector contam 확인에 enzyme activity 확인까지 했습니다. 또한
protion 확인과정은 제가 아닌 다른 전문가 분이 하셨고요
아무래도 expression이 안돼는거 같다는 결론이 나왔습니다.
처음으로 protein expression 해보는것입니다.
1. 질문
어떠한 방법을 더 해봐야 할까요ㅠㅠ ?
2 질문
우연히 X-gal,IPTG, LA plate 에 PET vector와 insert가 들어있는
BL21을 키우게 돼었는데요
PET Vector 에는 lacl 만 있는데.. blue colony 가
생겼습니다. 이게 무슨조화인지;;
성의 있는 답변 부탁드립니다.
제가 이것때문에 많이 힘들어요~ ㅠㅠ
다시 말씀드리지만 제가 초보라서.. ㅠㅠ
- cloning
- prtein expression
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
DELETED님의 답변
2009-08-20- 0
> > > 고수님들께 도움받고자 올립니다. > >제가 클론닝을 해서 현재 단백질 발현을 시키는중입니다. > >하지만 발현정도가 보이지않아서 고심하고 있는데요 > >일단 많이들 알고 계시는 클로닝은 넘어가겠습니다 > >(PCR-> T-vector cloning 후 sequencing 확인까지) > >insert(800bp)- T vector 까지는 이상이 없습니다. > >enzyme site 또한 이상이 없고요 > >expression vector는 PET-22b 이고요 > > >사용된 enzyme site 는 NdeI BamHI 입니다. > >잘라서서.. insert 없는 vector control 걸고 size 확인까지.. 했고요 > >vector contam 확인에 enzyme activity 확인까지 했습니다. 또한 > >protion 확인과정은 제가 아닌 다른 전문가 분이 하셨고요 > >아무래도 expression이 안돼는거 같다는 결론이 나왔습니다. > > > 처음으로 protein expression 해보는것입니다. > >1. 질문 > > 어떠한 방법을 더 해봐야 할까요ㅠㅠ ? > > > >2 질문 > > 우연히 X-gal,IPTG, LA plate 에 PET vector와 insert가 들어있는 > BL21을 키우게 돼었는데요 > > PET Vector 에는 lacl 만 있는데.. blue colony 가 > >생겼습니다. 이게 무슨조화인지;; > > >성의 있는 답변 부탁드립니다. > >제가 이것때문에 많이 힘들어요~ ㅠㅠ > >다시 말씀드리지만 제가 초보라서.. ㅠㅠ > > Re: GST나 MAL같은 다른 vector로 해 보세요.. 유전자에 따라 간혹 tagging종류에 따라 되는것과 안되는 것들이 있더라구요...