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지식나눔

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B16F1세포와 CCD-986sk 세포 배양시 문제가 생겼어요~고수님들의 많은 도움이 필요합니다..ㅠㅠ

2009-03-31 org.kosen.entty.User@70f4bc6e 권유빈(akero)
  • 2
B16F1 세포와 CCD986sk를 배양하고 있습니다. 보통의 세포를 배양할때 5%CO2에서 문안하게 자라는 것으로 알고 있습니다. 그런데 랩을 옮기고 나서 현재 랩에서는 10%CO2 조건에서 B16F1을 welgene 제품 DMEM으로 배양을 하고 CCD-986SK를 IMDM을 배양하고 있던데요. CCD-986sk상태가 P2짜리 해동해서도 금방 노화에 빠진 모양으로 바꿔어서요, 두가지 문제점을 다 보완하기 위해서 REVCO incubator CO2를 5%로 낮추고 B16F1세포를 우선 꺼내어 해동해 봤는데요. 세포가 부착을 못하고 있습니다. 빨리 세팅을 해야하는데 난감합니다~ 1. 세포가 원래 10%조건에서 전 실험자가 실험을 하셔서 적응된 것을 재 해동해서 그런건지 2. 아니면 제대로 REVCO incubator의 CO2가 잘 안맞는건지 (두번이나 다시 세팅을 실험실 다른 분이 했습니다. 설명서를 보시고서,, 아직 기술자를 부르지는 않았어요,,-사람 부르기가 좀 어려운 위치에 있습니다) 3. 다른 여타의 문제점은? 배지 회사를 바꿔봐야 하나요? 아니면 세포를 다른 랩에서 가서 배양해 봐야 하는지 다른 랩의 세포를 가져와서 여기서 해 봐야하는지 4. CCD986세포는 CO2 10%조건에서 노화가 되는지도 아울러 여쭤봅니다 많은 조언 부탁드릴께요~~
  • B16F1
  • CCD-986sk
  • CO2 10%
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답변 2
  • 답변

    신재욱님의 답변

    2009-03-31
    • 0
    먼저 CO2 incubator에 표시되어있는 CO2 절대적으로 믿으서는 안됩니다. 특히 산지 오래 되었고 기기 validation을 정기적으로 하지 않는 이상은요. 기기에 표시된 setting값을 맞추는것이 아니라 CO2표준물질을 가지고 맞추어야 합니다.(<--굉장히 고가임) 기존의 연구자가 사용하고 다시 stock해 놓으셨다고 했는데 stock이 잘 못 되었을 수도 있고 기존 연구자 분이 이 세포주를 얼마나 사용하신지 기록이 없으시면 아마 세포의 성장 genenration을 초과했을 수도 있습니다. 왜냐하면 세포가 generation이 지나면 growth와 production에 크게 문제가 됩니다. 10% CO2를 사용하시면 배지상에 녹아들어가는 pH가 상대적으로 많기 때문에 pH buffering 할 수 있는 시약을 좀 더 넣어주셔야 할 수도 있습니다. 기존에 사용하시던 분도 그렇게 했을 수 있지만, 세포가 많이 계대배양하거나 stock한지 오래 되셨으면 환경에 더 민감해졌을 수도 있습니다. CO2 incubator의 경우는 AS를 부르기 어려우시다면 똑같이 접종한 세포를 각기 다른 CO2에 넣어서 배양해 보시면 알게 될 것이고 pH의 경우는 세포가 자라든 안자라면 며칠 키울때 매일 주기적으로 한번 check해 보시기 바랍니다. 답변이 되었을지 모르겠지만, 성공하시기 바랍니다.
    답변수정
    먼저 CO2 incubator에 표시되어있는 CO2 절대적으로 믿으서는 안됩니다. 특히 산지 오래 되었고 기기 validation을 정기적으로 하지 않는 이상은요. 기기에 표시된 setting값을 맞추는것이 아니라 CO2표준물질을 가지고 맞추어야 합니다.(<--굉장히 고가임) 기존의 연구자가 사용하고 다시 stock해 놓으셨다고 했는데 stock이 잘 못 되었을 수도 있고 기존 연구자 분이 이 세포주를 얼마나 사용하신지 기록이 없으시면 아마 세포의 성장 genenration을 초과했을 수도 있습니다. 왜냐하면 세포가 generation이 지나면 growth와 production에 크게 문제가 됩니다. 10% CO2를 사용하시면 배지상에 녹아들어가는 pH가 상대적으로 많기 때문에 pH buffering 할 수 있는 시약을 좀 더 넣어주셔야 할 수도 있습니다. 기존에 사용하시던 분도 그렇게 했을 수 있지만, 세포가 많이 계대배양하거나 stock한지 오래 되셨으면 환경에 더 민감해졌을 수도 있습니다. CO2 incubator의 경우는 AS를 부르기 어려우시다면 똑같이 접종한 세포를 각기 다른 CO2에 넣어서 배양해 보시면 알게 될 것이고 pH의 경우는 세포가 자라든 안자라면 며칠 키울때 매일 주기적으로 한번 check해 보시기 바랍니다. 답변이 되었을지 모르겠지만, 성공하시기 바랍니다.
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  • 답변

    홍동호님의 답변

    2009-04-02
    • 0
    >B16F1 세포와 CCD986sk를 배양하고 있습니다. > >보통의 세포를 배양할때 5%CO2에서 문안하게 자라는 것으로 알고 있습니다. > >그런데 랩을 옮기고 나서 현재 랩에서는 10%CO2 조건에서 B16F1을 welgene 제품 DMEM으로 배양을 하고 CCD-986SK를 IMDM을 배양하고 있던데요. > >CCD-986sk상태가 P2짜리 해동해서도 금방 노화에 빠진 모양으로 바꿔어서요, > >두가지 문제점을 다 보완하기 위해서 REVCO incubator CO2를 5%로 낮추고 B16F1세포를 우선 꺼내어 해동해 봤는데요. > >세포가 부착을 못하고 있습니다. 빨리 세팅을 해야하는데 난감합니다~ > >1. 세포가 원래 10%조건에서 전 실험자가 실험을 하셔서 적응된 것을 재 해동해서 그런건지 > >2. 아니면 제대로 REVCO incubator의 CO2가 잘 안맞는건지 >(두번이나 다시 세팅을 실험실 다른 분이 했습니다. 설명서를 보시고서,, 아직 기술자를 부르지는 않았어요,,-사람 부르기가 좀 어려운 위치에 있습니다) > >3. 다른 여타의 문제점은? > 배지 회사를 바꿔봐야 하나요? > 아니면 세포를 다른 랩에서 가서 배양해 봐야 하는지 > 다른 랩의 세포를 가져와서 여기서 해 봐야하는지 > >4. CCD986세포는 CO2 10%조건에서 노화가 되는지도 아울러 여쭤봅니다 > > 많은 조언 부탁드릴께요~~ > > 또 다른 점검할 사항이 있습니다. 기본적으로 세포가 DMSO와 같이 얼려져 있기 때문에 해동시 최대한 빨리 배양액으로 바꾸어 주어야 합니다. 예를 들면, 액체질소 탱크에서 커내어서 바로 물로 넣으면 폭발의 위험이 있으므로 10-15초 정도 클린 벤치에서 방치해 두고 37도의 Bath에서 빠른 시간에 녹인 후 배양액을 5 ml 정도 추가하여 15 ml 튜브에 섞은 후 원심분리를 하여 supernatant를 버리고 Pellet에 배양액을 넣어서 suspension을 한 후에 처음에는 20% FBS로 하루 정도를 배양한 후에 원래의 배양조건으로 바꾸어 주면 잘 자랄 수 있습니다. 그래도 잘 자라지 않으면 배양 플라스크를 T25를 사용하지 말고 6-well에서 잠시 키우다가 상태가 좋아지면 T25로 옮길 수도 있습니다.
    답변수정
    >B16F1 세포와 CCD986sk를 배양하고 있습니다. > >보통의 세포를 배양할때 5%CO2에서 문안하게 자라는 것으로 알고 있습니다. > >그런데 랩을 옮기고 나서 현재 랩에서는 10%CO2 조건에서 B16F1을 welgene 제품 DMEM으로 배양을 하고 CCD-986SK를 IMDM을 배양하고 있던데요. > >CCD-986sk상태가 P2짜리 해동해서도 금방 노화에 빠진 모양으로 바꿔어서요, > >두가지 문제점을 다 보완하기 위해서 REVCO incubator CO2를 5%로 낮추고 B16F1세포를 우선 꺼내어 해동해 봤는데요. > >세포가 부착을 못하고 있습니다. 빨리 세팅을 해야하는데 난감합니다~ > >1. 세포가 원래 10%조건에서 전 실험자가 실험을 하셔서 적응된 것을 재 해동해서 그런건지 > >2. 아니면 제대로 REVCO incubator의 CO2가 잘 안맞는건지 >(두번이나 다시 세팅을 실험실 다른 분이 했습니다. 설명서를 보시고서,, 아직 기술자를 부르지는 않았어요,,-사람 부르기가 좀 어려운 위치에 있습니다) > >3. 다른 여타의 문제점은? > 배지 회사를 바꿔봐야 하나요? > 아니면 세포를 다른 랩에서 가서 배양해 봐야 하는지 > 다른 랩의 세포를 가져와서 여기서 해 봐야하는지 > >4. CCD986세포는 CO2 10%조건에서 노화가 되는지도 아울러 여쭤봅니다 > > 많은 조언 부탁드릴께요~~ > > 또 다른 점검할 사항이 있습니다. 기본적으로 세포가 DMSO와 같이 얼려져 있기 때문에 해동시 최대한 빨리 배양액으로 바꾸어 주어야 합니다. 예를 들면, 액체질소 탱크에서 커내어서 바로 물로 넣으면 폭발의 위험이 있으므로 10-15초 정도 클린 벤치에서 방치해 두고 37도의 Bath에서 빠른 시간에 녹인 후 배양액을 5 ml 정도 추가하여 15 ml 튜브에 섞은 후 원심분리를 하여 supernatant를 버리고 Pellet에 배양액을 넣어서 suspension을 한 후에 처음에는 20% FBS로 하루 정도를 배양한 후에 원래의 배양조건으로 바꾸어 주면 잘 자랄 수 있습니다. 그래도 잘 자라지 않으면 배양 플라스크를 T25를 사용하지 말고 6-well에서 잠시 키우다가 상태가 좋아지면 T25로 옮길 수도 있습니다.
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