2009-04-15
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주정훈(curior2000)
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NIH3T3 cell을 키우고 있습니다.
일반적인 culture 상태(100mm culture dish)에서는 Cell을 뿌려주고 나서
다음 날 아침에 보면 잘붙어있는것을 확인할수 있는데 18mm cover slip을
깔고 보면 잘 안붙어 있는데요! 무슨 차이인지 알고 계시면 도움 부탁드립니다.
(예전에는 18mm에도 잘 붙었다고 하네요)그리고 split 할때에 0.25% 1X짜리
trypsin을 1ml로 1분간 처리를 해주고 현미경으로 보면 Cell들이 하나씩 떨어져서
떠다니지 않고 뭉쳐서 다니는데요 trypin이 약할 경우 그렇다고 하는데 그럴경우
trypsin에 의해서 Cell attachment에 영향을 미칠 가능성이 있는지 알고 계신분
도움 부탁드립니다.
감사합니다.
- Cell
- Split
- trypsin
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 5
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답변
원아영님의 답변
2009-04-15- 0
사용하는 Trypsin의 농도가 어느 정도인지도 고려해야되고, 반응하는 온도도 중요한데요, 제가 그 세포를 키워본 경험은 없지만, 만약 그렇게 Trypsin에 센서티브한 세포라면 25도정도의 상온에서 반응시킬 수도 있습니다. 그리고 혹시 cover slip이 앞뒤가 있을 수도 있는데.. 확인해 보셨는지요? 저도 앞뒤가 있는 줄 모르고 썼다가 괜히 세포탓만 한적도 있거든요... 요즘엔 구분없이 나온다고는 하는데.. 간혹 그런것들도 있더라구요... 한번 확인해 보세요~ -
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황현두님의 답변
2009-04-15- 0
0.05% trypsin, 0.02% EDTA 용액으로 2-3분 정도 처리했을 경우 잘 되었습니다. coverslip의 경우 attachment가 culture dish보다 안되는 경우도 있었습니다. -
답변
장성재님의 답변
2009-04-16- 0
NIH3T3 cell는 비교적 배양하기 쉬운 세포주에 속합니다. 윗분들이 언급하신 대로 1X trypsin-EDTA를 사용하여 37도씨 배양기에서 2-5분간 반으시켜 주시면 깨끗하게 떨어지며, 일반적인 세포 배양용 용기에서 혈청이 들어간 배지 (아시다시피 혈청에는 trypsin inhibitor가 존재하므로)에서 배양하시면 문제없이 세포가 부착되고 배양 가능합니다. 따라서, 세포의 상태가 아주 좋지 않은 경우를 제외하곤 trypsin에 의한 영향은 거의 없다고 보셔도 무방합니다. 문제는 coverslip 상에서 배양하는 것인데, 일반적으로 culture dish (flask)에서는 손쉽게 부착 배양하실 수 있으나, 세포의 종류에 따라서 coverslip의 경우 부착성이 매우 떨어지는 경우가 존재합니다. 따라서, coverslip의 표면에 특정 화학물질이 코팅된 경우가 대부분인데, 코팅 기술에 따라서 매우 차이가 크며, 저의 경험으론 메어커에 따라서 많은 차이를 보인다는 사실을 확인한 바 있습니다. 참고로 직접 PLL (poly-L-lysine)이나 collagen 또는 gellatin, fibronectin 등의 세포의 접착성을 높혀주는 매트릭스를 코팅하여 사용하실 수도 있습니다. >NIH3T3 cell을 키우고 있습니다. >일반적인 culture 상태(100mm culture dish)에서는 Cell을 뿌려주고 나서 >다음 날 아침에 보면 잘붙어있는것을 확인할수 있는데 18mm cover slip을 >깔고 보면 잘 안붙어 있는데요! 무슨 차이인지 알고 계시면 도움 부탁드립니다. >(예전에는 18mm에도 잘 붙었다고 하네요)그리고 split 할때에 0.25% 1X짜리 >trypsin을 1ml로 1분간 처리를 해주고 현미경으로 보면 Cell들이 하나씩 떨어져서 >떠다니지 않고 뭉쳐서 다니는데요 trypin이 약할 경우 그렇다고 하는데 그럴경우 >trypsin에 의해서 Cell attachment에 영향을 미칠 가능성이 있는지 알고 계신분 >도움 부탁드립니다. >감사합니다.
주정훈(curior2000) 2009-04-16좋은 정보 감사합니다.
poly-L-lysine 코팅coversiip을 혹시 구매하여 사용해보신적 있으신가요?
가능하시다면 어디 제품이 좋은지 회사와 Cat #좀 알수있을까요?
직접 코팅을 해서 사용하려 해도 농도도 모르고 우선 코팅이 제대로
됐는지 확인할 방법을 몰라서요? 부탁드립니다.
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황현두님의 답변
2009-04-16- 0
PLL coated 제품은 잘 모르겠지만 KDR Biotech이라는 회사 (NUNC사 distributor)에 알아보시면 상대적으로 attachment가 잘 되는 coverslip을 구매하실 수 있습니다. Coating된 것도 있었던 것 같은데 써보지는 않았습니다. (문의하시면 친절하게 가르쳐 주실겁니다.) PLL을 직접 코팅하시려면 용액 농도를 0.01 mg/ml 정도로 만드시고 coverslip을 에탄올로 닦고 완전히 말린 후 떨어뜨려서 overnight incubation 시키시면 됩니다. (37도 CO2 chamber에 넣어두었더니 잘 되었습니다.) 용액을 떨어뜨리기 전에 plasma 처리를 하여 hydrophilic하게 해주면 효율이 훨씬 좋습니다. 단, PLL용액이 마르거나 농도가 너무 높으면 PLL 농도가 결정이 생길정도로 높아지고 이는 cell에 toxic할 수 있으니 주의하십시오. Incubation 후에는 다시 에탄올로 살짝 씻어서 말리시면 됩니다. (N2 gas blow를 하면 날아가는 경우도 있으니 그냥 pipette으로 씻어 말리는게 좋습니다.) coating 된것을 확인하는 방법은 contact angle을 보는 방법이 있고, 빛에 비추어봐도 살짝 보입니다. (빛 굴절률 차이 때문에..) 농도 조절을 위한 코팅 조건까지 확실히 잡으시려면 FITC-PLL을 이용해서 형광을 확인하셔도 됩니다. -
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전정용님의 답변
2009-06-30- 0
보통 cell culture용 dish가 아닌 경우에는 ECM 관련 코팅을 해줘야 세포가 자랄수 있습니다. PL 코팅처럼요... >NIH3T3 cell을 키우고 있습니다. >일반적인 culture 상태(100mm culture dish)에서는 Cell을 뿌려주고 나서 >다음 날 아침에 보면 잘붙어있는것을 확인할수 있는데 18mm cover slip을 >깔고 보면 잘 안붙어 있는데요! 무슨 차이인지 알고 계시면 도움 부탁드립니다. >(예전에는 18mm에도 잘 붙었다고 하네요)그리고 split 할때에 0.25% 1X짜리 >trypsin을 1ml로 1분간 처리를 해주고 현미경으로 보면 Cell들이 하나씩 떨어져서 >떠다니지 않고 뭉쳐서 다니는데요 trypin이 약할 경우 그렇다고 하는데 그럴경우 >trypsin에 의해서 Cell attachment에 영향을 미칠 가능성이 있는지 알고 계신분 >도움 부탁드립니다. >감사합니다.