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형광현미경을 이용한 정량화는 생각보다 쉽지 않습니다. 특히, 배양용기 (coverslip) 등에 고정되지 않은 상태의 suspended cell의 경우에는 불가능하다고 보시는 것이 좋지요. 설사 정량화에 성공한다고 하더라도 실험 결과를 해외 저널에 투고하실 때 공인된 실험법이 아닐 경우 rejection될 가능성이 큽니다. 따라서, 논문 등을 참조하시면 ROS 정량시 DCFH를 처리한 후 flow cytometry를 이용하여 측정한 것을 알 수 있으실 겁니다. 아래의 논문을 참고하세요. 1. Chang WK, Yang KD, and Shaio MD. Lymphocyte proliferation modulated by glutamine: involved in the endogenous redox reaction. Clin Exp Immunol. 1999; 117(3):482？8. 2. Yang KD, Shaio MF. Hydroxyl radicals as an early signal involved in phorbol ester-induced monocyte differentiation of HL60 cells. Biochem Biophys Res Commun. 1994;200:1650？7. 3. Wang JF, Jerrells TR, Spitzer JJ. Decreased production of reactive oxygen intermediates is an early event during in vitro apoptosis of rat thymocytes. Free Radic Biol Med. 1996;20:533？42. 4. Gaines H, Andersson L, Biberfeld G. A new method for measuring lymphoproliferation at the single-cell level in whole blood cultures by flow cytometry. J Immunol Methods. 1996;195:63？72. 그리고, 제 생각에는 washing의 경우도 3회 이상 반복하시는 것이 좋을 듯 싶군요. >혈액에서 PBMC만을 분리하여 특정 물질을 처리한 후 ROS를 측정하려고 합니다. >근데 PBMC를 분리하여 특정 물질을 처리하고 그 후 DCFH를 처리하고 나면 세포의 수가 급격하게 줄어듭니다. 처음에는 washing을 너무 많이해서 loss가 많은 것으로 생각하여 washing을 줄여서 실험해 보고 형광현미경으로 관찰했더니 배경까지 연두색의 형광을 띄어서 washing 조건만 잡는데도 고생했습니다. 근데 현미경으로 확인하니 정확하지 않아서 fluorospectrophotometer로 측정하려고 합니다. 논문들마다 방법도 다르고 또 PBMC로 ROS를 측정한 논문은 많이 없어서요...ㅠ.ㅠ 혹시 해 보신분이 계시다면 답변 부탁드립니다. > >그리고 제가 실험한 방법이 맞는지 확인도 부탁드려요~ > >1. 혈액에서 PBMC 분리한다. (Histopaque 1077 사용, 500xg, 30min, RT) >2. 1X PBS washing (3회 반복, 500xg, 5min, RT) >3. Tryphan blue로 cell counting >4. 원심분리하여 상등액 제거 후 PBMC에 물질 처리 (30min) >5. 원심분리하여 상등액 제거하고 1X PBS로 washing (500xg, 5min, RT) >6. 상등액 제거 후 DCFH 2uM 1ml 처리 (37℃ , 30min) >7. 1X PBS washing (2회, 500xg, 5min, RT) >8. 상등액은 완전히 제거한 다음 1X PBS를 소량넣어 resuspend 후 slide glass위에 점적하고 cover glass를 덮어 형광현미경으로 관찰