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microtubule staining 이 잘안돼요 도와주세요

2009-04-29 org.kosen.entty.User@7f083115 주정훈(curior2000)
  • 3
microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 1. washing (cold PBS once time on the ice) 2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix 3. washing (PBS) 4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize 5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) 6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) 7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) 8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution 9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) 10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution 11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
  • microtubule
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답변 3
  • 답변

    전정용님의 답변

    2009-06-11
    • 0
    protocol상에는 크게 이상이 없는듯 합니다 primary Ab 반응 시간을 어떻게 하시는지 말씀하시지 않아서 정확하지는 않겠지만 4도에서 overnight하는게 좋구요, primary Ab dilution 비율을 좀더 높여보시는것도 한 방법입니다. 2nd Ab비율도 마찬가지이구요. FITC면 형광이니 2nd Ab반응시킬때부터 호일이라든지 박스내에 보관하시다던지 해서 빛 차단해주시면 좋구요. >microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) > >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
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    protocol상에는 크게 이상이 없는듯 합니다 primary Ab 반응 시간을 어떻게 하시는지 말씀하시지 않아서 정확하지는 않겠지만 4도에서 overnight하는게 좋구요, primary Ab dilution 비율을 좀더 높여보시는것도 한 방법입니다. 2nd Ab비율도 마찬가지이구요. FITC면 형광이니 2nd Ab반응시킬때부터 호일이라든지 박스내에 보관하시다던지 해서 빛 차단해주시면 좋구요. >microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) > >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
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    전정용님의 답변

    2009-06-11
    • 0
    protocol상에는 크게 이상이 없는듯 합니다 primary Ab 반응 시간을 어떻게 하시는지 말씀하시지 않아서 정확하지는 않겠지만 4도에서 overnight하는게 좋구요, primary Ab dilution 비율을 좀더 높여보시는것도 한 방법입니다. 2nd Ab비율도 마찬가지이구요. FITC면 형광이니 2nd Ab반응시킬때부터 호일이라든지 박스내에 보관하시다던지 해서 빛 차단해주시면 좋구요. >microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) > >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
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    protocol상에는 크게 이상이 없는듯 합니다 primary Ab 반응 시간을 어떻게 하시는지 말씀하시지 않아서 정확하지는 않겠지만 4도에서 overnight하는게 좋구요, primary Ab dilution 비율을 좀더 높여보시는것도 한 방법입니다. 2nd Ab비율도 마찬가지이구요. FITC면 형광이니 2nd Ab반응시킬때부터 호일이라든지 박스내에 보관하시다던지 해서 빛 차단해주시면 좋구요. >microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) > >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다.
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    신동욱님의 답변

    2010-01-10
    • 0
    >microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) > >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다. Immunostaining의 Protocol에서는 전혀 문제가 없어보입니다. 그럼에도 불구하고 double staining이 안되었다면, Ab 자체에 문제가 있는 것 아닐까 싶습니다. 이럴 경우에는 실험 과정시에 기존에 잘되던 Ab로 confirm을 하시는 게 좋을 것 같습니다. double staining이라고 mono staining과 크게 다르지 않습니다.
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    >microtubule staining 을 하였는데 전혀 Detection이 되지 않았습니다. >microtubule staining시에 주의할점이나 staining이 잘 될수 있는 방법을 알고 >계신분 부탁드립니다. 사용하는 Cell은 NIH3T3 cell을 사용하고 있는데 혹시 다른 cell과 달리 특별히 주의할점이 있는건가요?기본적인 과정을 간단히 설명드리면 >1. washing (cold PBS once time on the ice) >2. 3.7% formaldehyde 로 30분간 fix >3. washing (PBS) >4. 0.2% triton X-100 in PBS로 30분간 permeabilize >5. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >6. Blocking with 2% BSA in TBST(0.1% triton X-100) >7. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >8. primary anti body : monoclonal anti alpha tubulin (1:1,000) in block solution >9. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) >10. secondary anti body : anti-mouse IgG (FITC-con) (1:100) in block solution >11. washing three time with TBST(0.1% triton X-100) > >F-actin과 더블로 staining 하는데요 혹시 더블 staining을 할때 주의할점이 있으면 >조언 부탁드립니다. 많은 과학자 분들의 도움 부탁드립니다. 감사합니다. Immunostaining의 Protocol에서는 전혀 문제가 없어보입니다. 그럼에도 불구하고 double staining이 안되었다면, Ab 자체에 문제가 있는 것 아닐까 싶습니다. 이럴 경우에는 실험 과정시에 기존에 잘되던 Ab로 confirm을 하시는 게 좋을 것 같습니다. double staining이라고 mono staining과 크게 다르지 않습니다.
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