2009-05-07
org.kosen.entty.User@788a089c
이유원(dreamway0)
- 2
이번에 첨으로 Western blot을 준비하게 되었는데,
저희과에서 두방이 하고 있더라고요..
한방은 secondary Ab로 peroxidase-conjugated Ab로 사용 후,
TMB substrate로 발색하고,
다른 한방은 HRP-conjugated Ab를 이용하여 ECL solution으로 발색하더군요
(위의 경우는 발색 후 스캐너로 스캔하고, 아래의 경우는 암실에서 film으로 현상하더군요)
두개의 경우가 어떤 차이가 있는지 알고 싶습니다.
원래는 아래 경우처럼 HRP-conhugated Ab를 이용하여 ECL로 발색할라고 했는데(제가 참고한 논문도 이 방법으로 하였습니다)
암실에서 film사용하는 것때문에 불편한것 같기도 하고요...
위의 경우가 편해보입니다-_-
참고로, 제가 보고자 하는 단백질은 약 6kD의 작은 단백질로, 플라스미드의 promoter농도 및 시간별로 발현량확인하려고 합니다.
- western blot
- substrate
- antibody
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2009-05-09- 0
우선 두가지 방법의 차이는 발색법과 화학발광법이라는 기질의 차이를 들 수가 있습니다. 예전에는 별도의 기기를 요하지 않아서 전자의 경우를 많이 사용했었습니다만, 이 방법은 Western blot에 적용할 경우 감도가 낮아서 최근에는 ELISA에서만 사용하는 것이 대부분입니다. 또한, 후자의 경우 높은 감도와 최근에 많은 관련 기기 (화학발광용 스캐너)들이 보급됨에 따라서 예전보다는 많이 사용되는 방법입니다. 과거에는 주로 암실에서 x-ray film을 이용하여 현상하였지만, 최근에는 앞서 말씀드린 바와 같이 전용 스캐너가 보급되고 있는 추세입니다. 결과적으로 후자를 사용하시는 편이 Western blot 시에 보다 높은 감도를 얻으실 수 있습니다. 대략 femtomole 이하 단위의 단백질까지 확인 가능하다는 사실...^^ 좀더 자세한 사항은 관련 시약 제조업체 (TMB substrate, ECL reagent)의 설멸서를 참조하시길 바랍니다. >이번에 첨으로 Western blot을 준비하게 되었는데, >저희과에서 두방이 하고 있더라고요.. >한방은 secondary Ab로 peroxidase-conjugated Ab로 사용 후, >TMB substrate로 발색하고, >다른 한방은 HRP-conjugated Ab를 이용하여 ECL solution으로 발색하더군요 >(위의 경우는 발색 후 스캐너로 스캔하고, 아래의 경우는 암실에서 film으로 현상하더군요) >두개의 경우가 어떤 차이가 있는지 알고 싶습니다. >원래는 아래 경우처럼 HRP-conhugated Ab를 이용하여 ECL로 발색할라고 했는데(제가 참고한 논문도 이 방법으로 하였습니다) >암실에서 film사용하는 것때문에 불편한것 같기도 하고요... >위의 경우가 편해보입니다-_- >참고로, 제가 보고자 하는 단백질은 약 6kD의 작은 단백질로, 플라스미드의 promoter농도 및 시간별로 발현량확인하려고 합니다. > -
답변
DELETED님의 답변
2009-08-21- 0
>이번에 첨으로 Western blot을 준비하게 되었는데, >저희과에서 두방이 하고 있더라고요.. >한방은 secondary Ab로 peroxidase-conjugated Ab로 사용 후, >TMB substrate로 발색하고, >다른 한방은 HRP-conjugated Ab를 이용하여 ECL solution으로 발색하더군요 >(위의 경우는 발색 후 스캐너로 스캔하고, 아래의 경우는 암실에서 film으로 현상하더군요) >두개의 경우가 어떤 차이가 있는지 알고 싶습니다. >원래는 아래 경우처럼 HRP-conhugated Ab를 이용하여 ECL로 발색할라고 했는데(제가 참고한 논문도 이 방법으로 하였습니다) >암실에서 film사용하는 것때문에 불편한것 같기도 하고요... >위의 경우가 편해보입니다-_- >참고로, 제가 보고자 하는 단백질은 약 6kD의 작은 단백질로, 플라스미드의 promoter농도 및 시간별로 발현량확인하려고 합니다. > Re: ECL로 할 경우 같은 memb.을 여러가지 ab로 다시 여러번, detection 할수 있는 장점이 있습니다.