2009-05-22
org.kosen.entty.User@64545200
장동민(enasio21)
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첨부파일
핵 단백질을 추출하는 키트를 구입해서 프로테인을 추출해서 W/B 하려고 합니다.
키트는 PIERCE에서 나오는 제품을 사용했습니다.
핵 단백질이 cytosol 프로테인에 컨탐되지 않았는지 확인하기 위해서~
HDAC1 (59 kDa)을 찍어 보려고 합니다.
이것이 핵 안에 존재한다고 하더라구요~
사진에 나와 있는 것이 찍은 결과 인데요~~
1,2 번은 cytosol protein 이구요~ 3,4번 레인은 nuclear protein 입니다.
1,2 번 레인은 55kDa 이하라서 non-specific으로 봐도 되는건지요??
너무 선명하게 나와서 의심이 됩니다.
그리고 loading contorl 로서 b-actin을 걸었는데요~
이건 핵 단백질에서는 나오면 안 된다고 하더라구요~
핵 단백질에서는 액틴이 나오는 것이 잘못된 건가요??
프로테인을 잘못 뽑은 걸까요??
2번 정도 반복 시행했는데~ 똑같이 나왔어요~
질문 1. 핵단백질 추출할때 HDAC1 으로 검정하는 것이 맞는가?
질문 2. actin이 사이토졸 단백질에만 있어야 하는건가?
질문 3. 1,2번 레인에 있는 밴드는 non-specific으로 봐도 되는건가?
고수님들의 조언 부탁드립니다.
누구 하나 딱 잘라 대답해 주는 이가 없네요~~
부탁드립니다.
- western
- nuclear protein extract
- actin
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
전정용님의 답변
2009-06-04- 0
웨스턴 사진을 보니까....전반적으로 마커 사이즈와 각 단백질의 사이즈가 차이가 나네요 마커 확인해 보시구요, actin이 핵단백질에서 보이지 않아야 하는 이유는 actin이 세포를 구성하는 cytoskeleton 구성성분이기 때문이죠, 따라서 핵내에는 존재하지 않습니다 웨스턴 밴드로 보았을때 cytosol과 핵 단백질에서 모두 동일한 양이 나올정도로 밴드가 확실하게 보이네요. 컨탐된게 맞는거 같구요. 핵단백질은 여러 사이트에서 확인 하실 수 있으니 찾아보시고 적당한 것으로 다시 확인해 보세요 -
답변
DELETED님의 답변
2009-08-21- 0
>핵 단백질을 추출하는 키트를 구입해서 프로테인을 추출해서 W/B 하려고 합니다. >키트는 PIERCE에서 나오는 제품을 사용했습니다. > >핵 단백질이 cytosol 프로테인에 컨탐되지 않았는지 확인하기 위해서~ >HDAC1 (59 kDa)을 찍어 보려고 합니다. >이것이 핵 안에 존재한다고 하더라구요~ > >사진에 나와 있는 것이 찍은 결과 인데요~~ >1,2 번은 cytosol protein 이구요~ 3,4번 레인은 nuclear protein 입니다. >1,2 번 레인은 55kDa 이하라서 non-specific으로 봐도 되는건지요?? >너무 선명하게 나와서 의심이 됩니다. > >그리고 loading contorl 로서 b-actin을 걸었는데요~ >이건 핵 단백질에서는 나오면 안 된다고 하더라구요~ >핵 단백질에서는 액틴이 나오는 것이 잘못된 건가요?? >프로테인을 잘못 뽑은 걸까요?? >2번 정도 반복 시행했는데~ 똑같이 나왔어요~ > >질문 1. 핵단백질 추출할때 HDAC1 으로 검정하는 것이 맞는가? >질문 2. actin이 사이토졸 단백질에만 있어야 하는건가? >질문 3. 1,2번 레인에 있는 밴드는 non-specific으로 봐도 되는건가? > > >고수님들의 조언 부탁드립니다. >누구 하나 딱 잘라 대답해 주는 이가 없네요~~ >부탁드립니다. > Re: contamination 된것 같긴하구요..fractionation을 좀더 잘해야 할것 같습니다. 참고로 nuclear marker로서 PARP1을 많이들 사용합니다.