2009-06-03
org.kosen.entty.User@308a641b
전은성(go1040)
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안녕하십니까?
transwell 을 이용하여 migration assay 를 하고 있는데,
migration 후 fixation, staining 하고 microscope 을 통해 확인하면,
초승달처럼 cell 이 많이 모이는 구간이 따로 생깁니다.
실험 과정을 간단히 설명드리면,
1. vitronectin 을 통해서 transwell membrane 의 low surface 를
450ul coating(>1hr). chamber 에 vitronectin 을 미리 넣어 둔 상태에서
insert를 넣은 것이 아니라, insert 사이의 공간을 통해 vitronectin을 넣었습니다.
( cell + protein 을 preincubation. 30mins)
2. insert를 다른 well 로 옮길 때 PBS 로 washing 후 low surface 를 suction.
3. 다른 well 로 옮긴 후 insrt 아래 surface 에는 media 만.
insert 위에는 cell + protein 를 넣고, 4시간 incuation
4. 포르말린으로 fixation, 후 cystal violet 으로 staining.
중간에 면봉으로 membrane 의 윗면만 닦아서 migration 하지 않은 것은 제거.
5. microscope 으로 cell counting.
방법은 크게 다르지 않은 것으로 생각됩니다만....
아무리 조심해도 staining 후 확인해 보면, insert 10개 중 7-8 개는 cell 들이
초승달 모양으로 몰려있는 현상을 보입니다.
coating 이 고르지 않아서일까요?
coating 후 PBS washing, suction step 에서 문제가 있어서 그런걸까요?
선생님들의 조언을 구합니다.^^;;
- migration assay
- vitronetin
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
전정용님의 답변
2009-06-04- 0
실험을 어떻게 하시는건지 정확히는 모르겠지만... 일단 cell들이 가장자리로 몰린다는 것은 첫째로 cell들을 inoculation할때 고루 퍼지지 않아서 생길수가 있구요 둘째로 면봉으로 membrane위쪽에 남아있는 세포들을 제거하실 경우에 가장자리까지 제대로 제거되지 않아서 이런 현상이 발생할 수 있습니다. cell들이 migration되었다고 생각하지만, 의외로 많이 이동되지 않았을수도 있습니다. 따라서 남아있던 cell들이 초승달 모양으로 남아있을수 있습니다 세번째는, 조심스럽게 잘 하셨겠지만 washing할때 너무 강하게 하면 간혹 세포들이 membrane에서 떨어져 나갈수 있습니다. 이런경우에 같은 현상이 나타날수 있습니다