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지식나눔

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cloning과정중 질문드립니다.

2009-06-22 org.kosen.entty.User@18dbf440 최미희(rainbow14)
  • 3
cloning과정 중 sequencing을 하잖아요. 그런데 sequencing결과 반응이 좋지 않다고 합니다. 결과가 나오긴 했는데 반응이 좋지 않다는 것은 무엇을 말하나요? 처음 T-vector에서 enzyme처리 하여 insert를 elution했을때 농도가 그다지 좋게 나오지 않더라고요 그럼에도 불구하고 ligation을 시켜보았습니다. 이런 영향으로 반응이 좋지 않다고 하겠죠? 그렇다면, enzyme 처리 하여 gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? enzyme의 buffer가 다른 관계로 하나씩 반응을 한 후. 에탄올 침전을 시킵니다. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? 간단하게 질문을 요약하면 1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? 2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? 3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? 아직도 학문의 갈길이 멀어 더욱더 재미 납니다. 고수님들 답변 부탁드립니다.^^
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  • sequence
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    전정용님의 답변

    2009-06-23
    • 0
    T-vector를 이용하셔서 실험하시는것 같은데요. http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/pro/tb150.html 참고하세요 sequencing결과에서 반응이 좋지 않다는것이 뭐가 잘 안나왔다고 하시는지 알 수가 없네요. 보통 T7이나 sp6 promoter부위를 가지고서 sequencing을 하는데 왠만해서는 잘 나오거든요. 반응이 좋지 않다는 얘기는 아마도 insert 자체내에 GC 가 많아서 잘 읽히지 않았다는 의미가 아닐까 생각됩니다. elution 농도가 낮게 되면, 보통 vector와 insert의 비율을 1:3으로 하는데, insert를 넣는 볼륨이 너무 많아지게 되고 이에 따라 vector와 insert가 만날 확률이 적어지겠죠.그렇게되면 cloning되는 확률도 적어지게될거구요. elution이 잘 되게 하려면 일단 enzyme cut이 잘 되야겠죠. gel running후에는 가급적 gle이 적게 들어가도록 잘 자르시구요, 좋은 비법 같은건 딱히 없고 가지고 계신 protocol 잘 따르시면 될것 같네요. 에탄올 침전은 아마도 enzyme cut 하신후에 침전과정을 말씀하시는것 같은데요, 에탄올 침전자체로 농도에 영향을 주는것 보다는 실험과정에 있어서 없어지는것 때문에 농도차이가 나는게 맞을겁니다. cut하는 emzyme이 다른 버퍼를 요해서 두번정도 에탄올 침천을 하시는것 같은데 버퍼 차이가 크게 나지 않는다면 double cut해보시게 어떨까 생각이 듭니다 http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/pro/tb150.html T-vector를 이용한 cloning 관련 사이트네요 참고해보세요 >cloning과정 중 sequencing을 하잖아요. >그런데 sequencing결과 반응이 좋지 않다고 합니다. >결과가 나오긴 했는데 반응이 좋지 않다는 것은 무엇을 말하나요? >처음 T-vector에서 enzyme처리 하여 insert를 elution했을때 농도가 그다지 좋게 나오지 않더라고요 >그럼에도 불구하고 ligation을 시켜보았습니다. >이런 영향으로 반응이 좋지 않다고 하겠죠? >그렇다면, enzyme 처리 하여 gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? >enzyme의 buffer가 다른 관계로 하나씩 반응을 한 후. 에탄올 침전을 시킵니다. >에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? >간단하게 질문을 요약하면 > >1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? >2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? >3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? > >아직도 학문의 갈길이 멀어 더욱더 재미 납니다. >고수님들 답변 부탁드립니다.^^
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    T-vector를 이용하셔서 실험하시는것 같은데요. http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/pro/tb150.html 참고하세요 sequencing결과에서 반응이 좋지 않다는것이 뭐가 잘 안나왔다고 하시는지 알 수가 없네요. 보통 T7이나 sp6 promoter부위를 가지고서 sequencing을 하는데 왠만해서는 잘 나오거든요. 반응이 좋지 않다는 얘기는 아마도 insert 자체내에 GC 가 많아서 잘 읽히지 않았다는 의미가 아닐까 생각됩니다. elution 농도가 낮게 되면, 보통 vector와 insert의 비율을 1:3으로 하는데, insert를 넣는 볼륨이 너무 많아지게 되고 이에 따라 vector와 insert가 만날 확률이 적어지겠죠.그렇게되면 cloning되는 확률도 적어지게될거구요. elution이 잘 되게 하려면 일단 enzyme cut이 잘 되야겠죠. gel running후에는 가급적 gle이 적게 들어가도록 잘 자르시구요, 좋은 비법 같은건 딱히 없고 가지고 계신 protocol 잘 따르시면 될것 같네요. 에탄올 침전은 아마도 enzyme cut 하신후에 침전과정을 말씀하시는것 같은데요, 에탄올 침전자체로 농도에 영향을 주는것 보다는 실험과정에 있어서 없어지는것 때문에 농도차이가 나는게 맞을겁니다. cut하는 emzyme이 다른 버퍼를 요해서 두번정도 에탄올 침천을 하시는것 같은데 버퍼 차이가 크게 나지 않는다면 double cut해보시게 어떨까 생각이 듭니다 http://wheat.pw.usda.gov/~lazo/methods/pro/tb150.html T-vector를 이용한 cloning 관련 사이트네요 참고해보세요 >cloning과정 중 sequencing을 하잖아요. >그런데 sequencing결과 반응이 좋지 않다고 합니다. >결과가 나오긴 했는데 반응이 좋지 않다는 것은 무엇을 말하나요? >처음 T-vector에서 enzyme처리 하여 insert를 elution했을때 농도가 그다지 좋게 나오지 않더라고요 >그럼에도 불구하고 ligation을 시켜보았습니다. >이런 영향으로 반응이 좋지 않다고 하겠죠? >그렇다면, enzyme 처리 하여 gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? >enzyme의 buffer가 다른 관계로 하나씩 반응을 한 후. 에탄올 침전을 시킵니다. >에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? >간단하게 질문을 요약하면 > >1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? >2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? >3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? > >아직도 학문의 갈길이 멀어 더욱더 재미 납니다. >고수님들 답변 부탁드립니다.^^
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    김은민님의 답변

    2009-06-23
    • 0
    >1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? sequencing reaction이 들어갈때, 중요하게 작용하는 것들이 있습니다. 일단 plasmid concentration!!! (적당한 양의 plasmid를 보내셨나요?) 또한, plasmid의 purity (혹시 manual 방법으로 prep하여 보내신건 아니신가요?) 지저분한 Plasmid DNA를 보내셨거나, 소량을 보내셨는지 확인해보시기 바랍니다. 어떠한 경우에는 primer가 plasmid에 binding하는 reaction이 제대로 안 일어나기도 하니, 다른 primer를 이용하는 방법도 한 가지 방법입니다. >2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? 예전엔 gell elution도 manual로 하였으나, 요새는 gel elution kit등을 사용하오니, Kit에 들어있는 solution이나 culume에 문제가 없는 한, 제대로 elution될 것이라 생각되네요. 양을 많이 원하신다면, 처음 enzyme reaction시 Plasmid DNA의 양을 늘이세요. >3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 주진 않습니다. enzyme reaction 이후에 에탄올 침전시 E.tube 바닥에 pellet이 안보일거예요. (당연히 양이 적을테니까요.) 그러나.. pellet이 보인다고 생각하고 일을 해보세요. centrifuge 할때, tube를 항상 동일한 방향으로 넣고!! 에탄올 제거할 때, pellet이 있다고 생각되는 부분을 피해 파이펫팅을 하시는 방법으로, 자기 주문을 외워보세요. 에탄올 침전은 의외로 농도에 영향을 주지 않습니다. 좋은 답변이 되셨으면 좋겠네요.
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    >1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? sequencing reaction이 들어갈때, 중요하게 작용하는 것들이 있습니다. 일단 plasmid concentration!!! (적당한 양의 plasmid를 보내셨나요?) 또한, plasmid의 purity (혹시 manual 방법으로 prep하여 보내신건 아니신가요?) 지저분한 Plasmid DNA를 보내셨거나, 소량을 보내셨는지 확인해보시기 바랍니다. 어떠한 경우에는 primer가 plasmid에 binding하는 reaction이 제대로 안 일어나기도 하니, 다른 primer를 이용하는 방법도 한 가지 방법입니다. >2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? 예전엔 gell elution도 manual로 하였으나, 요새는 gel elution kit등을 사용하오니, Kit에 들어있는 solution이나 culume에 문제가 없는 한, 제대로 elution될 것이라 생각되네요. 양을 많이 원하신다면, 처음 enzyme reaction시 Plasmid DNA의 양을 늘이세요. >3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 주진 않습니다. enzyme reaction 이후에 에탄올 침전시 E.tube 바닥에 pellet이 안보일거예요. (당연히 양이 적을테니까요.) 그러나.. pellet이 보인다고 생각하고 일을 해보세요. centrifuge 할때, tube를 항상 동일한 방향으로 넣고!! 에탄올 제거할 때, pellet이 있다고 생각되는 부분을 피해 파이펫팅을 하시는 방법으로, 자기 주문을 외워보세요. 에탄올 침전은 의외로 농도에 영향을 주지 않습니다. 좋은 답변이 되셨으면 좋겠네요.
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    오용식님의 답변

    2009-06-25
    • 0
    >1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? T-vector를 사용했을때 sequencing이 제대로 안됐다는 것은 거의 드뭅니다. 제 경험에 의하면 T-vector를 사용하여 seq-ing 하면 굉장히 결과가 잘 옵니다.. 그런데 글을 읽어보니 vector에서 insert 부분만 gel elution하여 seq-ing을 하신다는 것 같은데..제가 이해한 것이 맞나요?? 만약 그런것이라면 이 자체가 잘못된 것이구요, insert가 들어간 vector 자체를 seq-ing 의뢰하시구요, primer는 T7과 sp6를 쓰시면 될것 같네요, insert 부분만 gel elution하여 seq-ing 하시겠다면, 가급적 EtBr 염색을 하지 마시기 바랍니다. EtBr이 seq-ing 결과에 영향을 많이 줍니다. >2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? 뭐, 특별히 좋은 방법이 있을까요? 요즘 kit을 많이 사용하는데.. 하지만 제 경험에 의하면 gel-elution은 실험실 setting이 어떻게 되어 있냐에 따라 손을 좀 타는 것 같습니다. 무슨 말인고 하니... 저 같은 경우 library 제작을 위해 gDNA를 gel elution하여 cloning에 사용을 했는데요 EtBr staining을 한것과 하지 않은 것 간의 ligation된 정도가 차이가 있었습니다... 그러니.. 이것은 개개인이 자신에게 맞는 실험법을 찾는 것이 좋지 않을까 생각되네요..^^;; >3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? 에탄올 침전 과정은 DNA 농도에 영향을 줄 수도, 주지 않을 수도 있습니다.. kit을 쓴다면 큰 영향을 주지 않겠지만, manual로 한다면 영향을 주기도 합니다. 침전 온도, 침전 시간, 원심분리 시간 등등.. manual로 하신다면, 간단한 자료를 드릴테니 말씀하세요, kit을 쓰실 경우는 에탄올이 제대로 dry 되고 나서 elution을 하셔야 전기영동시 elution 용액이 붕~ 뜨지 않는다는 것은 알고 계시겠죠? ^^;; kit을 쓰신다면, 그닥 크게 신경 안쓰셔도 될 문제라 생각됩니다..
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    >1. sequencing결과 반응이 좋지 않다는 뜻이 무엇인가요? T-vector를 사용했을때 sequencing이 제대로 안됐다는 것은 거의 드뭅니다. 제 경험에 의하면 T-vector를 사용하여 seq-ing 하면 굉장히 결과가 잘 옵니다.. 그런데 글을 읽어보니 vector에서 insert 부분만 gel elution하여 seq-ing을 하신다는 것 같은데..제가 이해한 것이 맞나요?? 만약 그런것이라면 이 자체가 잘못된 것이구요, insert가 들어간 vector 자체를 seq-ing 의뢰하시구요, primer는 T7과 sp6를 쓰시면 될것 같네요, insert 부분만 gel elution하여 seq-ing 하시겠다면, 가급적 EtBr 염색을 하지 마시기 바랍니다. EtBr이 seq-ing 결과에 영향을 많이 줍니다. >2. gel-elution 할때 좋게 나오는 비법 같은게 있을까요? 뭐, 특별히 좋은 방법이 있을까요? 요즘 kit을 많이 사용하는데.. 하지만 제 경험에 의하면 gel-elution은 실험실 setting이 어떻게 되어 있냐에 따라 손을 좀 타는 것 같습니다. 무슨 말인고 하니... 저 같은 경우 library 제작을 위해 gDNA를 gel elution하여 cloning에 사용을 했는데요 EtBr staining을 한것과 하지 않은 것 간의 ligation된 정도가 차이가 있었습니다... 그러니.. 이것은 개개인이 자신에게 맞는 실험법을 찾는 것이 좋지 않을까 생각되네요..^^;; >3. 에탄올 침전 과정에서 DNA의 농도에 영향을 줄까요? 에탄올 침전 과정은 DNA 농도에 영향을 줄 수도, 주지 않을 수도 있습니다.. kit을 쓴다면 큰 영향을 주지 않겠지만, manual로 한다면 영향을 주기도 합니다. 침전 온도, 침전 시간, 원심분리 시간 등등.. manual로 하신다면, 간단한 자료를 드릴테니 말씀하세요, kit을 쓰실 경우는 에탄올이 제대로 dry 되고 나서 elution을 하셔야 전기영동시 elution 용액이 붕~ 뜨지 않는다는 것은 알고 계시겠죠? ^^;; kit을 쓰신다면, 그닥 크게 신경 안쓰셔도 될 문제라 생각됩니다..
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