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지식나눔

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cloning 중 ligation에서 막히는 문제..

2009-06-24 org.kosen.entty.User@33e24c79 최하나(only1hana)
  • 4
T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. 다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 ligation부터 막힙니다.. ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, 버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... 사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, 저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. 몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ 미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ
  • cloning
  • ligation
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답변 4
  • 답변

    전정용님의 답변

    2009-06-24
    • 0
    여러시도를 해보셨네요. 적혀져 있지 않아서 말씀드리는건데 e-cut을 할때 single cut 으로 하면 대부분 CIP 작업을 합니다. 그렇지 않으면 self가 많이 생기게 되죠. cloning자체가 vector와 insert의 만날 기회에 따라서 결과가 달라지는것이기 때문에 CIP처리하여 self ligation을 줄이는게 중요합니다. 비율을 여러가지로 해보셨다니 더 말씀드리진 않겠구요, 혹시 모르니 ligase도 타 회사제품으로 한번 사용해 보심이 어떨런지요. >T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. >다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. >insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; >e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 >ligation부터 막힙니다.. >ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, >버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... >사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, >저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. > >몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ >미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ
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    여러시도를 해보셨네요. 적혀져 있지 않아서 말씀드리는건데 e-cut을 할때 single cut 으로 하면 대부분 CIP 작업을 합니다. 그렇지 않으면 self가 많이 생기게 되죠. cloning자체가 vector와 insert의 만날 기회에 따라서 결과가 달라지는것이기 때문에 CIP처리하여 self ligation을 줄이는게 중요합니다. 비율을 여러가지로 해보셨다니 더 말씀드리진 않겠구요, 혹시 모르니 ligase도 타 회사제품으로 한번 사용해 보심이 어떨런지요. >T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. >다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. >insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; >e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 >ligation부터 막힙니다.. >ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, >버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... >사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, >저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. > >몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ >미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ
    최하나(only1hana) 2009-06-24

    조언 감사드립니다 (..) e-cut은 더블컷으로 시행하였습니다..ㅠㅠ이번달에도 안되면 타회사 ligase를 구입하는 것을 검토해봐야겠습니다.

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    박수제님의 답변

    2009-06-24
    • 0
    아래 덧글 보니깐. 더블-cut하신다고 하시니깐.. self-ligation될 확률은 적겠네요.. 그럼 ligation 온도를 조절하시는 것은 어떨까요? 그리고 cut되는 부위가 cohensive인가요? 이런 것도.. 영향을 미치는 것 같습니다... >T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. >다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. >insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; >e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 >ligation부터 막힙니다.. >ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, >버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... >사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, >저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. > >몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ >미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ
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    아래 덧글 보니깐. 더블-cut하신다고 하시니깐.. self-ligation될 확률은 적겠네요.. 그럼 ligation 온도를 조절하시는 것은 어떨까요? 그리고 cut되는 부위가 cohensive인가요? 이런 것도.. 영향을 미치는 것 같습니다... >T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. >다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. >insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; >e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 >ligation부터 막힙니다.. >ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, >버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... >사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, >저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. > >몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ >미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ
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    오용식님의 답변

    2009-06-25
    • 0
    2 kb라는 size가 문제가 되진 않으실것 같구요, 우선은 ligase가 제대로 활성을 나타내는지부터 알아보세요, ligation을 몇도에서 얼마동안 반응시켜야 하네,,, 메뉴얼에는 어떻게 하라네... 솔직히 반응온도, 반응시간 그리 중요하지 않습니다. 그래도, 이왕이면 제품의 메뉴얼대로 하시는게 좋을것 같구요, 아마 요즘 제품들이 보통 25도씨 1시간 정도 반응하라 할겁니다.. 그렇게 써 있으면 그냥 그렇게 하시면 되요, 그럼 다 됩니다. 제가 이런 경험이 있어서 말씀드립니다. 저는 vector의 농도를 높여서 사용할 것을 추천하네요.. 지금 사용하시는 vector의 농도가 적당하지 않을 가능성이 클 것 같아요, 보통 ligase 메뉴얼 보시면 vector를 50ng-200ng 을 사용하라고 적혀있습니다. 200ng 사용해보시구요 그래도 안나오면 더 많이 사용해보세요, 또 하나, elution하신다고 했는데, 제가 Etbr 염색 한것과 하지 않은 것으로 ligation해봤는데 transformation 해보면 둘 사이의 colony 수 차이가 확연히 나타납니다.. 근데, 이건 개개인 손을 타는 것 같아요, 누군 염색해서 써도 잘 된다는거 보면,^^; 제 경우는 이 두가지만 해보고나서 cloning 별 문제 없이 잘 되고 있습니다. enzyme 새로 구입하셨다는데, enzyme엔 더이상 문제 없다고 생각되지만.. 그래도 각 enzyme의 활성 체크는 꼭 해보시구요, 나머지 다른 상황에 초점을 두시고 troubleshooting 하세요... 괜한거에 힘빼실 필요 없습니다... 도움 되셨으면 좋겠네요..^^;;
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    2 kb라는 size가 문제가 되진 않으실것 같구요, 우선은 ligase가 제대로 활성을 나타내는지부터 알아보세요, ligation을 몇도에서 얼마동안 반응시켜야 하네,,, 메뉴얼에는 어떻게 하라네... 솔직히 반응온도, 반응시간 그리 중요하지 않습니다. 그래도, 이왕이면 제품의 메뉴얼대로 하시는게 좋을것 같구요, 아마 요즘 제품들이 보통 25도씨 1시간 정도 반응하라 할겁니다.. 그렇게 써 있으면 그냥 그렇게 하시면 되요, 그럼 다 됩니다. 제가 이런 경험이 있어서 말씀드립니다. 저는 vector의 농도를 높여서 사용할 것을 추천하네요.. 지금 사용하시는 vector의 농도가 적당하지 않을 가능성이 클 것 같아요, 보통 ligase 메뉴얼 보시면 vector를 50ng-200ng 을 사용하라고 적혀있습니다. 200ng 사용해보시구요 그래도 안나오면 더 많이 사용해보세요, 또 하나, elution하신다고 했는데, 제가 Etbr 염색 한것과 하지 않은 것으로 ligation해봤는데 transformation 해보면 둘 사이의 colony 수 차이가 확연히 나타납니다.. 근데, 이건 개개인 손을 타는 것 같아요, 누군 염색해서 써도 잘 된다는거 보면,^^; 제 경우는 이 두가지만 해보고나서 cloning 별 문제 없이 잘 되고 있습니다. enzyme 새로 구입하셨다는데, enzyme엔 더이상 문제 없다고 생각되지만.. 그래도 각 enzyme의 활성 체크는 꼭 해보시구요, 나머지 다른 상황에 초점을 두시고 troubleshooting 하세요... 괜한거에 힘빼실 필요 없습니다... 도움 되셨으면 좋겠네요..^^;;
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    DELETED님의 답변

    2009-08-13
    • 0
    >T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. >다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. >insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; >e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 >ligation부터 막힙니다.. >ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, >버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... >사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, >저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. > >몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ >미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ Re. 2kb 의 insert size는 전혀 큰것이 안닙니다. cloning은 그냥 하시는데로 하면될것 같고, 무식한 방법이지만 안될때는 vec. ins. 량을 늘리는것이 최상이더군요.. 또한 CIP나 SAP등 phosphatase를 처리 할 경우, inactivation을 한 후 gel extraction하는것이 좋습니다. CIP의 경우 gel elution만으로는 활성이 남아있는 경우가 있으니까요..또한 vec를 linearize하여 분리할때, 낮은 % gel을 이용하여 되도록 천천히 길게 running하는 것이 좋습니다. circular or supercoiled DNA를 배제하고, linearized DNA만 분리하는 것이 중요하니까요.. 대부분 vec. preparation에서 문제들이 발생하니까요..
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    >T-vector에 들어있는 insert를 다른 vector에 클로닝 하고 있습니다. >다른 클로닝과 조금 다른 것이 있다면.. >insert 사이즈가 2kb로 좀 크다는 것;; >e-cut이랑 elution까지는 깔끔하게 잘 되고요 >ligation부터 막힙니다.. >ligation도 비율별로 여러번 해보고 컴셀이나 플레이트, >버퍼나 시약을 다 바꿔봐도 안되네요... >사이즈가 좀 큰 것들은 남다파지클로닝으로 하면 비교적 잘 된다고는 하는데, >저희 랩은 그런 시스템은 없고요.. 그냥 일반적인 클로닝 시스템 입니다. > >몇 달째 여러사람이 매달리고 있는데..ㅠㅠ >미팅때마다 이것때문에 엄청 깨지고 있어서 진짜 힘듭니다..ㅠㅠ Re. 2kb 의 insert size는 전혀 큰것이 안닙니다. cloning은 그냥 하시는데로 하면될것 같고, 무식한 방법이지만 안될때는 vec. ins. 량을 늘리는것이 최상이더군요.. 또한 CIP나 SAP등 phosphatase를 처리 할 경우, inactivation을 한 후 gel extraction하는것이 좋습니다. CIP의 경우 gel elution만으로는 활성이 남아있는 경우가 있으니까요..또한 vec를 linearize하여 분리할때, 낮은 % gel을 이용하여 되도록 천천히 길게 running하는 것이 좋습니다. circular or supercoiled DNA를 배제하고, linearized DNA만 분리하는 것이 중요하니까요.. 대부분 vec. preparation에서 문제들이 발생하니까요..
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