2009-07-03
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김동주(catwave)
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제가 실험을 하고있는데 gst를 붙여서 발현시키는 단백질이 계속 inclusion body 로 떨어져서 이것을 souble한 폼으로 만들어야 하는데 쉽지가 않네요.
알고계시는 분들 좀 가르켜 주시면 안될까요??ㅜ 급합니다.ㅠ 빠른답변 부탁드립니다
- gst
- inclusion body
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2009-07-03- 0
어떤 발현계를 사용하십니까? 우선, E.coli를 이용하시는 발현계를 사용하시는 경우에는 inclusion body 상태로 정제를 하신 후에 단백질의 refolding 반응을 거침으로써 soluble 형태로 전환시키실 수 있습니다. 목적하시는 단백질의 종류에 따라서 차이가 있을 수 있습니다, 다른 방법으로는 발현계를 prokaryotic system에서 eukaryotic system으로 변경하시는 것도 한가지 방법일 수 있습니다. Inclusion body의 정제법과 단백질의 refolding 방법은 분자생물학 관련 실험서를 참고하시길 바랍니다. 교과서에 나온 고전적인 방법 이외에도 PIERCE, Takara bio, Qiagen 등 관련 메어커에서 다양한 kit류를 판매하고 있으니 관련 메이커의 홈페이지를 참고하셔도 좋습니다. >제가 실험을 하고있는데 gst를 붙여서 발현시키는 단백질이 계속 inclusion body 로 떨어져서 이것을 souble한 폼으로 만들어야 하는데 쉽지가 않네요. >알고계시는 분들 좀 가르켜 주시면 안될까요??ㅜ 급합니다.ㅠ 빠른답변 부탁드립니다 -
답변
장성재님의 답변
2009-07-03- 0
시간적이나 비용적인 면을 비교했을 때, 현재 E.coli를 이용한 발현계를 사용하고 계신다면, inclusion body를 solubilization하는 방법 즉, refolding하시는 방법이 가장 손쉽게 적용하실 수 있는 방법입니다. Inclusion body는 불용성이므로 세포를 파괴하신 후 손쉽게 분리하실 수 있으며, 이를 8 M Urea (또는 6M guanidine hydrochloride)를 이용하여 완전히 용해시키신 후 단계적으로 Urea의 농도를 낮추는 step-dialysis를 통하여 단백질의 refolding하시는 것이 가장 기본적인 틀이라고 보시면 됩니다. 이때 적당한 pH를 유지해주기 위한 buffer를 사용하는 것이 중요합니다. 그러나, 단백질의 종류에 따라서 완벽한 refolding이 이루어지지 않는 경우도 있으니 세밀한 검토가 요구됩니다. 님이 원하시는 타겟 단백질의 정보나 현재 사용하고 계시는 발현계에 대한 정보가 없기 때문에 이 이상을 요구하시는 것은 무리가 있습니다. >제가 실험을 하고있는데 gst를 붙여서 발현시키는 단백질이 계속 inclusion body 로 떨어져서 이것을 souble한 폼으로 만들어야 하는데 쉽지가 않네요. >알고계시는 분들 좀 가르켜 주시면 안될까요??ㅜ 급합니다.ㅠ 빠른답변 부탁드립니다
방법중에 효율적인 방법이 있으면 알려주실수 없을까요??