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지식나눔

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16s rRNA 균동정방법.

2009-09-28 org.kosen.entty.User@3f2d23a 임민수(lmsxing)
  • 3
균을 동정하고 있습니다. 16s rRNA로 동정하라고 하는데 제가 아무리 찾아봐도 잘 모르겟습니다.ㅠㅠ 16s rRNA로 균동정하는 실험방법 좀 자세히 알려주실 고수님들 부탁드립니다.ㅜㅜ 균종은 혐기적 조건에서 Lactobacilli MRS agar (DIFCO)에서 분리하여 젖산균 속으로 생각되고 API Kit 결과로 정확히 동정되지 않았습니다. 16s rRNA를 이용한 균동정방법의 프로토콜과 프라이머에 관해 알려주세요 ㅠㅠ
  • 16s rRNA
  • 동정
  • 균
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답변 3
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    장성재님의 답변

    2009-09-29
    • 0

    첨부파일

    첨부한 논문을 참고하시길 바랍니다. >균을 동정하고 있습니다. > >16s rRNA로 동정하라고 하는데 제가 아무리 찾아봐도 잘 모르겟습니다.ㅠㅠ > >16s rRNA로 균동정하는 실험방법 좀 자세히 알려주실 고수님들 부탁드립니다.ㅜㅜ > >균종은 혐기적 조건에서 Lactobacilli MRS agar (DIFCO)에서 분리하여 젖산균 속으로 생각되고 > >API Kit 결과로 정확히 동정되지 않았습니다. > >16s rRNA를 이용한 균동정방법의 프로토콜과 프라이머에 관해 알려주세요 ㅠㅠ > >
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    첨부한 논문을 참고하시길 바랍니다. >균을 동정하고 있습니다. > >16s rRNA로 동정하라고 하는데 제가 아무리 찾아봐도 잘 모르겟습니다.ㅠㅠ > >16s rRNA로 균동정하는 실험방법 좀 자세히 알려주실 고수님들 부탁드립니다.ㅜㅜ > >균종은 혐기적 조건에서 Lactobacilli MRS agar (DIFCO)에서 분리하여 젖산균 속으로 생각되고 > >API Kit 결과로 정확히 동정되지 않았습니다. > >16s rRNA를 이용한 균동정방법의 프로토콜과 프라이머에 관해 알려주세요 ㅠㅠ > >
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  • 답변

    이호용님의 답변

    2009-09-30
    • 0

    첨부파일

    참고논문 하나 첨부합니다. Table 1. 보시면 해당 primer sequence를 확인하실수 있으실 겁니다. 기본적인 프로토콜을 나열하자면, 1. genomic DNA 추출 2. 16S rDNA Univesal primer이용 PCR 3. PCR이후 gel running 4. Gel extraction 5. Sequencing의뢰 6. 결과분석 (NCBI web) 자세한 사항은 논문 보면서 확인하세요. >균을 동정하고 있습니다. > >16s rRNA로 동정하라고 하는데 제가 아무리 찾아봐도 잘 모르겟습니다.ㅠㅠ > >16s rRNA로 균동정하는 실험방법 좀 자세히 알려주실 고수님들 부탁드립니다.ㅜㅜ > >균종은 혐기적 조건에서 Lactobacilli MRS agar (DIFCO)에서 분리하여 젖산균 속으로 생각되고 > >API Kit 결과로 정확히 동정되지 않았습니다. > >16s rRNA를 이용한 균동정방법의 프로토콜과 프라이머에 관해 알려주세요 ㅠㅠ > >
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    참고논문 하나 첨부합니다. Table 1. 보시면 해당 primer sequence를 확인하실수 있으실 겁니다. 기본적인 프로토콜을 나열하자면, 1. genomic DNA 추출 2. 16S rDNA Univesal primer이용 PCR 3. PCR이후 gel running 4. Gel extraction 5. Sequencing의뢰 6. 결과분석 (NCBI web) 자세한 사항은 논문 보면서 확인하세요. >균을 동정하고 있습니다. > >16s rRNA로 동정하라고 하는데 제가 아무리 찾아봐도 잘 모르겟습니다.ㅠㅠ > >16s rRNA로 균동정하는 실험방법 좀 자세히 알려주실 고수님들 부탁드립니다.ㅜㅜ > >균종은 혐기적 조건에서 Lactobacilli MRS agar (DIFCO)에서 분리하여 젖산균 속으로 생각되고 > >API Kit 결과로 정확히 동정되지 않았습니다. > >16s rRNA를 이용한 균동정방법의 프로토콜과 프라이머에 관해 알려주세요 ㅠㅠ > >
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    오용식님의 답변

    2009-09-30
    • 0
    bacteria 16S rRNA gene PCR에는 universal primer인 27F와 1492R을 사용합니다. 이 primer를 사용하면 왠만한 bacteria의 16S rRNA gene을 PCR할 수 있습니다... PCR 방법은,, 우선 DNA를 추출해서 하는 방법이 있고 colony를 그대로 사용하는 방법이 있습니다... 시간이 아까우시다면 colony를 그대로 이용하세요 일반 PCR과 과정은 모두 똑같고, 다만 template DNA 대신 균의 colony를 넣고 PCR한다는 차이 뿐입니다. gram positive의 경우 colony PCR이 잘 안되는데, 그럴 경우에는 E-tube에 균과 DW를 넣고 잘 섞어준 후 전자렌지에 3분정도 끓이시고, 이것을 template DNA 대신 1ul 사용하시면 잘 됩니다. colony의 양이 너무 많아도 PCR이 잘 안됩니다. 이럴때는 멸균한 DW를 사용해서 colony를 어느정도 희석시킨 후에 사용하시면 됩니다. 꼭!! 멸균한 DW를 사용하셔야 하며 PCR에 사용되는 모든 기구 및 시약은 멸균 상태이여야 합니다. 27F와 1492R은 universal primer이기 때문에 원치 않은 오염균의 16S rRNA gene이 PCR 될 수 있습니다. 때문에 negative contol,,(template DNA를 넣지 않고 PCR 한것)을 함께 PCR하여 오염이 되지는 않았는지 확인하셔야 합니다. 만약 오염이 되었다면, 시약을 바꾸시던가 해서 다시 하셔야 합니다. PCR을 하고나면 전기영동 상에서 약 1.5 kbp의 PCR product가 관찰될 겁니다. 전기영동에는 1ul정도만 사용하시면 되구요 size가 제대로 관찰이 되었다면 그 다음 실험을 진행하시면 됩니다. 전기영동하고 남은 반응액을 PCR purification kit을 사용하여 정제하시고 sequencing 하시면 됩니다. 간혹 정제를 했는데도 dimer가 남아있어 sequencing이 제대로 안되는 경우가 있으니 dimer는 가능한 깨끗하게 제거하시고 sequencing 하시요, sequencing하여 얻은 결과는 NCBI의 BLAST에서 nucleotide BLAST를 사용하여 비교하시면 됩니다. 다른 균들과의 similarity가 함께 제공이 되므로 비교적 쉽게 동정하실 수 있을거에요 좋은 결과 얻으시길..^^; 답글 다 써놓고 '목록으로'를 클릭하여 다시 쓰는...이런..;; ㅋ 처음 썼던 내용이랑..어째 조금 다르다는 생각이 드는것은... 기분탓일까요..;;;
    답변수정
    bacteria 16S rRNA gene PCR에는 universal primer인 27F와 1492R을 사용합니다. 이 primer를 사용하면 왠만한 bacteria의 16S rRNA gene을 PCR할 수 있습니다... PCR 방법은,, 우선 DNA를 추출해서 하는 방법이 있고 colony를 그대로 사용하는 방법이 있습니다... 시간이 아까우시다면 colony를 그대로 이용하세요 일반 PCR과 과정은 모두 똑같고, 다만 template DNA 대신 균의 colony를 넣고 PCR한다는 차이 뿐입니다. gram positive의 경우 colony PCR이 잘 안되는데, 그럴 경우에는 E-tube에 균과 DW를 넣고 잘 섞어준 후 전자렌지에 3분정도 끓이시고, 이것을 template DNA 대신 1ul 사용하시면 잘 됩니다. colony의 양이 너무 많아도 PCR이 잘 안됩니다. 이럴때는 멸균한 DW를 사용해서 colony를 어느정도 희석시킨 후에 사용하시면 됩니다. 꼭!! 멸균한 DW를 사용하셔야 하며 PCR에 사용되는 모든 기구 및 시약은 멸균 상태이여야 합니다. 27F와 1492R은 universal primer이기 때문에 원치 않은 오염균의 16S rRNA gene이 PCR 될 수 있습니다. 때문에 negative contol,,(template DNA를 넣지 않고 PCR 한것)을 함께 PCR하여 오염이 되지는 않았는지 확인하셔야 합니다. 만약 오염이 되었다면, 시약을 바꾸시던가 해서 다시 하셔야 합니다. PCR을 하고나면 전기영동 상에서 약 1.5 kbp의 PCR product가 관찰될 겁니다. 전기영동에는 1ul정도만 사용하시면 되구요 size가 제대로 관찰이 되었다면 그 다음 실험을 진행하시면 됩니다. 전기영동하고 남은 반응액을 PCR purification kit을 사용하여 정제하시고 sequencing 하시면 됩니다. 간혹 정제를 했는데도 dimer가 남아있어 sequencing이 제대로 안되는 경우가 있으니 dimer는 가능한 깨끗하게 제거하시고 sequencing 하시요, sequencing하여 얻은 결과는 NCBI의 BLAST에서 nucleotide BLAST를 사용하여 비교하시면 됩니다. 다른 균들과의 similarity가 함께 제공이 되므로 비교적 쉽게 동정하실 수 있을거에요 좋은 결과 얻으시길..^^; 답글 다 써놓고 '목록으로'를 클릭하여 다시 쓰는...이런..;; ㅋ 처음 썼던 내용이랑..어째 조금 다르다는 생각이 드는것은... 기분탓일까요..;;;
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