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>안녕하세요? >제가 실험을 하나 했는데 이해하기가 조금 난해해서요. >제목이 Separation of glucose from Bovine serum albumin by gel filteration인데요, 과정은 > >A 1X10 cm clumn사이즈의 Sephadex G25 fine, equilibrated with water, is supplied together with an aqueous solution containing unknown concentrations of glucose and BSA (bovine serum albumin) > >1. start column running and determine the number of drops per ml in order that 1 ml fractions can be collected later by counting the drops. 최소한 5 ml 의 양을 실린더에 채우고 devide by the appropriate value to obtain a reasonably accurate count- collecting 1 ml will produce gross erros. >- 물을 계속 column에 공급하여 말르지 않게 하고 >2. Layer 1 ml of glucose- BSA solution from a 1 ml pipette on the top of the sephadex, collecting 1ml fractions immediately by counting the drops. >3. When the glucose-BSA has completely entered the gel carefully apply 1ml of water to the top of the column to ensure that all test material passes into gel in as narrow a band as possible. After this 1 ml addition has entered the gel pipette a further 2 ml of water on to the top of the column and then carefully fill up the column with water- >4. 1ml씩 14개의 샘플에 모은다. >5. Remove 0.1 ml from each fraction, and dilute it in 0.9 ml of water then carry out Nelson's assay.(당정량, 넬슨분석법) >6. 각각의 fraction에서 0.5ml의 샘플을 채취해 0.5ml의 water를 넣고 뷰렛단백질 정량을 한다. >7. Calculate the glucose and protein content of each fraction. >8. Calculate the concentrations of glucose and protein in the original solution. 단백질과 glucose가 채취되는 각각의 fraction은 첨가된 1ml의 샘플에서 온것임을 명심한다. > 실험에 대한 구체적 설명과 예시 혹시 알고계시면 써주시면 감사하겠습니다. >A 1X10 cm clumn사이즈의 Sephadex G25 fine, equilibrated with water, is supplied together with an aqueous solution containing unknown concentrations of glucose and BSA (bovine serum albumin) ---> 1X10 cm clumn사이즈의 fine type의 Sephadex G25을 길이 10cm이고 직경이 1cm인 column에 충진한 후에 3차 증류수로 평형화시킨후에, 미지농도의 glucose와 BSA가 함유되어 있는 수용액을 컬럼의 상부에 loading시킴. >1. start column running and determine the number of drops per ml in order that 1 ml fractions can be collected later by counting the drops. 최소한 5 ml 의 양을 실린더에 채우고 devide by the appropriate value to obtain a reasonably accurate count- collecting 1 ml will produce gross erros. ---> 컬럼 작동을 시작하되, 1mL 분획이 얼마큼의 drops으로 모아지는지 drops을 수를 정확히 카운팅할 것. 이때 물을 계속 column에 공급하여 말르지 않게 함. (최소 5 mL양을 실린더에 넣은 상태에서 1mL을 모으기 위한 정확한 drops수를 카운팅 하기위해 모아진 총 양을 나눠워 볼것) >2. Layer 1 ml of glucose- BSA solution from a 1 ml pipette on the top of the sephadex, collecting 1ml fractions immediately by counting the drops. ---> 컬럼에 충진된 Sephadex의 윗 부분에 1 mL pippet으로 glucose와 BSA가 혼합된 시료 용액 1mL을 loading시킴, 이때 시료를 loading하기 위해서는 이동상인 물을 적절히 빼주되, Sephadex 상부가 완전히 dry되지 않도록 주의해야 함. 시료 로딩 후에 drops수를 카운팅하여 1mL을 모음. >3. When the glucose-BSA has completely entered the gel carefully apply 1ml of water to the top of the column to ensure that all test material passes into gel in as narrow a band as possible. After this 1 ml addition has entered the gel pipette a further 2 ml of water on to the top of the column and then carefully fill up the column with water- ---> glucose-BSA 혼합 용액이 완전히 Sephadex gel속으로 들어갔을때, 3차 증류스 1mL을 조심스럽게 gel 상부에 흘려주는데, 시료 용액이 가능한 하나의 좁은 밴드모양을 이루면서 gel을 빠져나가는지를 확인해야 함. 이것은 시료의 분리능에 영향을 주는 요소들이므로 시료 loading시에 주의사항임. 물 1mL이 gel속으로 스며들게 한 후에, 다시 2 mL 물을 더 흘려주면서 이동상인 물을 완전히 채워줌. >4. 1ml씩 14개의 샘플에 모은다. >5. Remove 0.1 ml from each fraction, and dilute it in 0.9 ml of water then carry out Nelson's assay.(당정량, 넬슨분석법) ---> 4번의 과정에서 모아진 각 분획의 0.1 mL을 덜어내어서 이것을 물 0.9 mL로 희석시킨후에, Nelson's assay을 이용해 당을 정량함. (Nelson's assay는 환원당 정량법중에 하나로서 Cu+2이 환원당에 의해 Cu+1로 환원되어지고(step 1), arsenomolybdic acid(무색)의 첨가로 Cu+1이 Cu+2로 산화되어짐(step 2). 결과적으로 파란색의 arsenomolybdic acid로 변화게 됨. 당(glucose)의 양의 Cu+1의 양과 직접적으로 비례하게 됨.) >6. 각각의 fraction에서 0.5ml의 샘플을 채취해 0.5ml의 water를 넣고 뷰렛단백질 정량을 한다. ---> Biuret 반응이란, 단백질이나 펩타이드의 존재를 확인하는 정색반응의 하나로서 두 개 이상의 펩티드결합을 가지고 있는 화합물들을 알칼리성 용액에서 묽은 황산구리로 처리하면 자주색(또는 보라색)을 띠는 물질을 생성함. 즉, 시료의 수용액에 NaOH의 수용액을 소량 가하여 알칼리성으로 하고 여기에 황산구리 CuSO4를 5%로 한 수용액을 가하면 적자색을 띰. 단백질이나 펩티드만이 아니라 뷰렛 H₂NCONHCONH₂라도 색이 나타나므로 이렇게 부름. 일반적으로 1개의 탄소원자 또는 질소원자를 사이에 두고 2개의 CONH를 가진 것이나 직접 2개의 CONH기등이 결합하는 것에서 볼 수 있으며 트리펩타이드 이상의 사슬을 가진 것이 발색함. 또 이 반응에 의하면 발색하는 물질은 그림과 같은 반응식에 의하여 생성하는 비스(뷰타렛)구리(ⅱ)산나트륨 Na[Cu(C₂H₃O₂N₃)]임.) >7. Calculate the glucose and protein content of each fraction. ---> 위 방법대로 수행한 결과, glucose와 BSA의 양을 계산함. >8. Calculate the concentrations of glucose and protein in the original solution. 단백질과 glucose가 채취되는 각각의 fraction은 첨가된 1ml의 샘플에서 온것임을 명심한다. ---> 결과적으로 전체 용액에 포함된 glucose와 BSA의 농도를 계산할 수 있음.