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>wester blot 한 결과입니다. > >아무리 조건을 바꾸어봐도 non-specific binding이 계속 뜨고 >제가 원하는 band는 진하게 나오지도 않습니다. > >일단 조건을 말씀드리자면... >protein 30ug수준이고 7% SDS-PAGE 50V 30min / 100V 1hr 20min >transfer 350mM for 1hr 20min (PVDFmembrane 활성시 : methanol 5초 담근후 DW헹구고 Transfer에 15분이상 담궈둠) > >blocking buffer 1hr (3%BSA) Twice washing with TBST >Primary Ab (photo 1 - 1:150 goat Ab) (photo 2 - 1:100 goat Ab) -Santa cruz >Secondary Ab (Donkey anti-goat IgG 1:5000) - Santa cruz >Detection : ECL solution (GE) > >membrane에 ECL solution을 푹 담궈둔채(교수님왈) 5초 살짝 흔들어주고, 카세트에 넣고 10min 후 developer에 약 2분~3분 담궈뒀습니다. 이때 band나오는 것을 확인하였을때, 대략 2분~3분 사이였습니다. > >Specific band 160/170kDa(photo 1), 60kDa (photo 2) >Sample : 한 sample내에서 분획 별로 분리해서 각각 같은 protein 존재시 달라지는 band 두께 확인하고 싶어서 나눠서 걸었습니다. > >먼저 photo 1 >원하는 band는 160/170kDa라고 하는데 non-specific band가 많고 >게다가 오히려 100kDa근처의 band가 진하게 나오는 점이 이상합니다. >여러번 했을때도 이런 패턴으로 나옵니다. >그리고 background가 너무 지저분합니다. 원인이 무엇일까요??? > > >Photo 2 >이것은 60kDa정도는 나오는 것 같은데 band가 하나로 깨끗하게 나온게 아니라 >두개의 band가 겹쳐져서 나온듯 합니다. > >게다가 이 Ab도 non-specific bind이 굉장히 심한 것 같습니다. > > >이렇게 두 사진을 보셨을때 고수님들의 명쾌한 조언 부탁드립니다. > 사진 상으로는 non-specific이 굉장히 심한 수준은 아닌 것 같습니다. 그리고 간혹 원하는 사이즈보다 다른 곳의 밴드가 더 진한 경우도 있고요, 마커의 사이즈를 100% 신뢰하셔서는 안되고요.. 마커마다, 혹은 셀마다 약간씩은 오차가 있습니다. 일단 저희 랩과 웨스턴의 프로토콜이 부분적으로 약간은 다르기에.. non-specific이 나오는 이유 몇가지만 적어볼게요. 저도 고수는 아니라서 큰 도움이 될련지 모르겠습니다. 1. protein의 문제 : 셀에서 protein을 잘못 뽑아서 깨지거나 샘플 만들때 잘못 만들면 이런식으로 나올 수가 있습니다. 2. TBST washing이 덜 된 경우 3. development 시 노출이 너무 많을 경우 4. protein이나 Ab, 혹은 사용하는 버퍼나 gel 만드는 시약 등이 오염 되었을 경우.. 등등 아주 많습니다. 그리고 다른 분들은 모르겠지만, 전 만약 100kDa의 protein을 확인한다고 하면, 70~130kDa정도로 membrane을 잘라내서 실험합니다.(transfer 후에) 그래야 핸들링도 편하고 시약도 덜 들고 그러니까요. 이론적으로 트러블 슈팅이 어려울 때는 그냥 셀부터 시작해서 시약들 하나하나 다 다시 만들어가면서 찾다보면 어느새 SDS gel 조성까지도 %별로 외우고 있는 자신을 발견하게 됩니다;;

답변하신 분 말처럼 여러가지 요인이 있어서 콕 찍을수는 없습니다.. 이것저것 모두 체크하셔야 합니다.. 하지만 우선 백그라운드 발색이 많이 된다면... 세가지 이유가 거의 대부분입니다. 1. blocking 이 제대로 되지 않았거나 항체 wash 가 안된 경우 2. 발색 시간이 너무 긴 경우.. 3. 1차 혹은 2차 항체의 농도를 너무 진하게 쓴경우 해결책은 간단하겠죠?? blocking buffer의 경우 농도 늘이거나 시간늘이거나 종류 바꾸거나 등등등.... 다음으로 nonspecific protein binding 이 많은 경우, ( 백그라운드 발색하곤 다름니다) 1. 항체의 농도를 너무 쎄게 쓴경우( 위와 동일 이유) 2. 항체의 specificity가 떨어지는 경우 입니다. 회사에서 구입하더라도 그런 경우 있습니다. 해결책은 항체의 농도를 줄여서 적정 항체 농도를 체크하여, 사용해야 하며, 다른 항체를 구입하거나, 주사하여 얻은 poly 항체라면 주사에 사용된 항원단백질의 purity에 신경을 써야 합니다.. western 에서 깨끗한 band를 얻으려면 단백질과 항체의 농도가 매우 중요합니다.. 특히 님처럼 원하는 단백질이 잘 잡히지 않으면 항체를 높게 사용하는 경우가 많아요.. 다른 이유들에 의해서도 님과 같은 결과가 나올수 있지만, 우선은 제가 말한 것들 부터 체크 하셔야 합니다..

>wester blot 한 결과입니다. > >아무리 조건을 바꾸어봐도 non-specific binding이 계속 뜨고 >제가 원하는 band는 진하게 나오지도 않습니다. > >일단 조건을 말씀드리자면... >protein 30ug수준이고 7% SDS-PAGE 50V 30min / 100V 1hr 20min >transfer 350mM for 1hr 20min (PVDFmembrane 활성시 : methanol 5초 담근후 DW헹구고 Transfer에 15분이상 담궈둠) > >blocking buffer 1hr (3%BSA) Twice washing with TBST >Primary Ab (photo 1 - 1:150 goat Ab) (photo 2 - 1:100 goat Ab) -Santa cruz >Secondary Ab (Donkey anti-goat IgG 1:5000) - Santa cruz >Detection : ECL solution (GE) > >membrane에 ECL solution을 푹 담궈둔채(교수님왈) 5초 살짝 흔들어주고, 카세트에 넣고 10min 후 developer에 약 2분~3분 담궈뒀습니다. 이때 band나오는 것을 확인하였을때, 대략 2분~3분 사이였습니다. > >Specific band 160/170kDa(photo 1), 60kDa (photo 2) >Sample : 한 sample내에서 분획 별로 분리해서 각각 같은 protein 존재시 달라지는 band 두께 확인하고 싶어서 나눠서 걸었습니다. > >먼저 photo 1 >원하는 band는 160/170kDa라고 하는데 non-specific band가 많고 >게다가 오히려 100kDa근처의 band가 진하게 나오는 점이 이상합니다. >여러번 했을때도 이런 패턴으로 나옵니다. >그리고 background가 너무 지저분합니다. 원인이 무엇일까요??? > > >Photo 2 >이것은 60kDa정도는 나오는 것 같은데 band가 하나로 깨끗하게 나온게 아니라 >두개의 band가 겹쳐져서 나온듯 합니다. > >게다가 이 Ab도 non-specific bind이 굉장히 심한 것 같습니다. > > >이렇게 두 사진을 보셨을때 고수님들의 명쾌한 조언 부탁드립니다. > 1. 무엇보다, gel의 resolution 즉, separation이 덜 된 측면이 있는 만큼 PAGE의 %를 낮추시는 게 좋겠습니다. 2. nonspecific band가 많은 경우, 5% skim milk in TBST를 Overnight (4도)를 하여, 1st Ab를 반응시키고, 2nd Ab도 1: 5000 정도 titer를 낮춰서 1-2시간 (4도)에서 반응을 하시면 좋을 듯 싶습니다.