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PCR시, 두개의 primer Tm 값이 차이가 많이 날 때 질문입니다ㅠㅠ

2009-11-19 org.kosen.entty.User@5caa2241 김남희(candeeys)
  • 4
안녕하세요~ 실험하다가 막히는 부분이 있어서 질문드립니다. PCR시, 두개의 primer Tm 값이 차이가 많이 날 때는 annealing temperature를 어떻게 맞춰야 할까요? primer는 f- aac att tct aac aaa tgt r- agt cct ctt cgg tcc gag cct tct t 이구요. applied biosystems에 주문을 하였는데, data sheet에 Tm값이 써있지 않아요;;; web에서 여러 싸이트에서 알아보면 우선 forward는 36, 40, 46도 정도로 나오고, reverse는 61, 68, 71도 정도로 나오더라구요.. 이렇게 두 프라이머의 Tm값에 차이가 많이 나면 annealing temperate를 어떻게 정해야하나요? 낮은 온도부근에서 잡으면 될까요? 저는 예전에 낮은 온도에서 1도 정도 뺀 온도에서 하라고 배웠었거든요.. 그런데, 검색해보니 낮은 온도에서 3도 올려서 잡아보라는 말도 있고... 제가 40, 42도에서 해봤는데 크기가 다르게 나오더라구요. sequence상에서는 product가 657bp 정도 나와야 하는데, 600bp 정도가 나왔어요.. 어찌해야 할까요?? 답변 부탁드려요ㅠ_ㅠ
  • PCR
  • primer Tm
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    서기원님의 답변

    2009-11-20
    • 0
    뭐 PCR 이라는게 실험 목적이나 실험 종류에 여러 가지가 있어서.. 정확한 답변이 될런지 모르겠지만. PCR로 정량을 하는 경우라면 당연 최적 조건을 맞추는게 중요하기 대문에 , TM값이 낮은 primer(1)를 기준으로 해서 보통 5~10도 낮은 온도 부터 시작해서.. 1도씩 온도를 올려가면 최적 컨디션을 찾아야 함니다.(그러다 보면 때로는 최적이 조건이 (1)번 primer의 TM값보다 높을수도 있습니다.) 높은 TM 값 primer(2)를 기준으로 하면 PCR자체가 안되는 경우 있기 때문에. 어째든.. 여러번의 PCR을 통해서 알아내는 수밖에.. 그리고 만약 최적 조건을 찾을수 없다면... primer둘중 하나를 다시 제작하면 됩니다. 경우에 따라 다르지만, 님의 실험에 적합하게 (1)primer 를 (2)번 TM값에 맞추어 제작하거나 혹은 반대로 하면 되겠죠.. 20~30mer 수준에서라면 비싸봐야 2~3마넌 이면 하니깐.. 괜히 실험 잘 안되는데.. 반복하는 것보다는 훨씬 빠르고 좋을수 있습니다. 다음.. 그냥 어떤 유전자를 cloning 하는 경우라면.. 그냥... PCR이 원하는 DNA를 증폭하기만 하면 되기때문에.. 이왕이면 최적 조건이면 좋지만 꼭 고려할 필요는 없습니다. 다른 DNA band 상관없이.. 원하는 싸이즈 분리하여 사용하면 되기 때문에 그냥.. 적당히 안전하게 (1)번 primer 5~10도 낮은 온도 사이에서 하면 됩니다. anneling 온도 라는게 TM값에서 몇도 낮은 온도 에서 해라 하는 일반적인 프로토콜은 있지만 말대로 일반적인 경우에서만이지 본인 실험에서도 적용되는 것은 아님니다.. 특히 실험자가 사용하는 tamplate DNA의 영향을 많이 받는데.. 이건 실험자마다 다 다를테니깐요.. 굳이 몇도를 신경쓸 필요가 없이 본인 실허에 맞추어야 한다는 말씀 드리고 싶네요.. 그리고.. 원하는 size가 650bp라고 했는데 gel running시에 600bp 정도 나왔다고 했는데. 무엇과 비교하고 어떤 젤로 내렸는지 모르겠지만.. 그정도의 크기 차이론 다른 DNA 생각하는것은 좀 무리가 있습니다.. 일반 agarose gel 이더라도 600 혹은 650 control DNA와 비교했거나 아님 acrylamide PAGE 로 running 한 경우에는 그 차이를 확실히 구분할수 있지만, 일반 agarose gel running 혹은 단순히 size marker와만 비교하셨다면 실제와 다를수 있습니다. 실험 결과를 볼수 없어서 답변이 될지 모르겠지만. 좋은 결과 얻으세요..
    답변수정
    뭐 PCR 이라는게 실험 목적이나 실험 종류에 여러 가지가 있어서.. 정확한 답변이 될런지 모르겠지만. PCR로 정량을 하는 경우라면 당연 최적 조건을 맞추는게 중요하기 대문에 , TM값이 낮은 primer(1)를 기준으로 해서 보통 5~10도 낮은 온도 부터 시작해서.. 1도씩 온도를 올려가면 최적 컨디션을 찾아야 함니다.(그러다 보면 때로는 최적이 조건이 (1)번 primer의 TM값보다 높을수도 있습니다.) 높은 TM 값 primer(2)를 기준으로 하면 PCR자체가 안되는 경우 있기 때문에. 어째든.. 여러번의 PCR을 통해서 알아내는 수밖에.. 그리고 만약 최적 조건을 찾을수 없다면... primer둘중 하나를 다시 제작하면 됩니다. 경우에 따라 다르지만, 님의 실험에 적합하게 (1)primer 를 (2)번 TM값에 맞추어 제작하거나 혹은 반대로 하면 되겠죠.. 20~30mer 수준에서라면 비싸봐야 2~3마넌 이면 하니깐.. 괜히 실험 잘 안되는데.. 반복하는 것보다는 훨씬 빠르고 좋을수 있습니다. 다음.. 그냥 어떤 유전자를 cloning 하는 경우라면.. 그냥... PCR이 원하는 DNA를 증폭하기만 하면 되기때문에.. 이왕이면 최적 조건이면 좋지만 꼭 고려할 필요는 없습니다. 다른 DNA band 상관없이.. 원하는 싸이즈 분리하여 사용하면 되기 때문에 그냥.. 적당히 안전하게 (1)번 primer 5~10도 낮은 온도 사이에서 하면 됩니다. anneling 온도 라는게 TM값에서 몇도 낮은 온도 에서 해라 하는 일반적인 프로토콜은 있지만 말대로 일반적인 경우에서만이지 본인 실험에서도 적용되는 것은 아님니다.. 특히 실험자가 사용하는 tamplate DNA의 영향을 많이 받는데.. 이건 실험자마다 다 다를테니깐요.. 굳이 몇도를 신경쓸 필요가 없이 본인 실허에 맞추어야 한다는 말씀 드리고 싶네요.. 그리고.. 원하는 size가 650bp라고 했는데 gel running시에 600bp 정도 나왔다고 했는데. 무엇과 비교하고 어떤 젤로 내렸는지 모르겠지만.. 그정도의 크기 차이론 다른 DNA 생각하는것은 좀 무리가 있습니다.. 일반 agarose gel 이더라도 600 혹은 650 control DNA와 비교했거나 아님 acrylamide PAGE 로 running 한 경우에는 그 차이를 확실히 구분할수 있지만, 일반 agarose gel running 혹은 단순히 size marker와만 비교하셨다면 실제와 다를수 있습니다. 실험 결과를 볼수 없어서 답변이 될지 모르겠지만. 좋은 결과 얻으세요..
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    DELETED님의 답변

    2010-01-04
    • 0
    >안녕하세요~ >실험하다가 막히는 부분이 있어서 질문드립니다. > >PCR시, 두개의 primer Tm 값이 차이가 많이 날 때는 >annealing temperature를 어떻게 맞춰야 할까요? > >primer는 > > >f- aac att tct aac aaa tgt > > >r- agt cct ctt cgg tcc gag cct tct t 이구요. > >applied biosystems에 주문을 하였는데, data sheet에 Tm값이 써있지 않아요;;; >web에서 여러 싸이트에서 알아보면 >우선 forward는 36, 40, 46도 정도로 나오고, >reverse는 61, 68, 71도 정도로 나오더라구요.. > >이렇게 두 프라이머의 Tm값에 차이가 많이 나면 >annealing temperate를 어떻게 정해야하나요? > >낮은 온도부근에서 잡으면 될까요? >저는 예전에 낮은 온도에서 1도 정도 뺀 온도에서 하라고 배웠었거든요.. >그런데, 검색해보니 낮은 온도에서 3도 올려서 잡아보라는 말도 있고... > >제가 40, 42도에서 해봤는데 크기가 다르게 나오더라구요. >sequence상에서는 product가 657bp 정도 나와야 하는데, 600bp 정도가 나왔어요.. > >어찌해야 할까요?? 답변 부탁드려요ㅠ_ㅠ > Re: forward primer가 좀 짧긴하지만, 45도 에서 55도 정도 까지 gradient PCR을 해보실길 권장합니다.
    답변수정
    >안녕하세요~ >실험하다가 막히는 부분이 있어서 질문드립니다. > >PCR시, 두개의 primer Tm 값이 차이가 많이 날 때는 >annealing temperature를 어떻게 맞춰야 할까요? > >primer는 > > >f- aac att tct aac aaa tgt > > >r- agt cct ctt cgg tcc gag cct tct t 이구요. > >applied biosystems에 주문을 하였는데, data sheet에 Tm값이 써있지 않아요;;; >web에서 여러 싸이트에서 알아보면 >우선 forward는 36, 40, 46도 정도로 나오고, >reverse는 61, 68, 71도 정도로 나오더라구요.. > >이렇게 두 프라이머의 Tm값에 차이가 많이 나면 >annealing temperate를 어떻게 정해야하나요? > >낮은 온도부근에서 잡으면 될까요? >저는 예전에 낮은 온도에서 1도 정도 뺀 온도에서 하라고 배웠었거든요.. >그런데, 검색해보니 낮은 온도에서 3도 올려서 잡아보라는 말도 있고... > >제가 40, 42도에서 해봤는데 크기가 다르게 나오더라구요. >sequence상에서는 product가 657bp 정도 나와야 하는데, 600bp 정도가 나왔어요.. > >어찌해야 할까요?? 답변 부탁드려요ㅠ_ㅠ > Re: forward primer가 좀 짧긴하지만, 45도 에서 55도 정도 까지 gradient PCR을 해보실길 권장합니다.
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    신동욱님의 답변

    2010-01-09
    • 0
    f- aac att tct aac aaa tgt 이 primer의 Tm값이 낮으므로, 이 primer에 맞춰서 annealing temp를 맞춰줘야 합니다. 원하는 유전자에 두 primer가 모두 annealing을 해야 하기 때문입니다. 40도까지 낮췄는데, 원하는 size가 안나왔다고 하니, 좀 더 annealing temp를 36도, 38도까지 낮추는 방법을 해보시고 정 안되면, 위 primer에 5'쪽으로, a, t 등 관련없는 서열을 3-5개 정도 더 이어서 새로 합성을 하셔야 합니다. 바이오 실험하면서, 가장 중요한 것은 시간입니다. 실험이 또 다른 조건 잡는 실험을 낳으면 소중한 연구 시간이 달아나게 되는 것입니다.
    답변수정
    f- aac att tct aac aaa tgt 이 primer의 Tm값이 낮으므로, 이 primer에 맞춰서 annealing temp를 맞춰줘야 합니다. 원하는 유전자에 두 primer가 모두 annealing을 해야 하기 때문입니다. 40도까지 낮췄는데, 원하는 size가 안나왔다고 하니, 좀 더 annealing temp를 36도, 38도까지 낮추는 방법을 해보시고 정 안되면, 위 primer에 5'쪽으로, a, t 등 관련없는 서열을 3-5개 정도 더 이어서 새로 합성을 하셔야 합니다. 바이오 실험하면서, 가장 중요한 것은 시간입니다. 실험이 또 다른 조건 잡는 실험을 낳으면 소중한 연구 시간이 달아나게 되는 것입니다.
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    전정용님의 답변

    2010-02-05
    • 0
    >안녕하세요~ >실험하다가 막히는 부분이 있어서 질문드립니다. > >PCR시, 두개의 primer Tm 값이 차이가 많이 날 때는 >annealing temperature를 어떻게 맞춰야 할까요? > >primer는 > > >f- aac att tct aac aaa tgt > > >r- agt cct ctt cgg tcc gag cct tct t 이구요. > >applied biosystems에 주문을 하였는데, data sheet에 Tm값이 써있지 않아요;;; >web에서 여러 싸이트에서 알아보면 >우선 forward는 36, 40, 46도 정도로 나오고, >reverse는 61, 68, 71도 정도로 나오더라구요.. > >이렇게 두 프라이머의 Tm값에 차이가 많이 나면 >annealing temperate를 어떻게 정해야하나요? > >낮은 온도부근에서 잡으면 될까요? >저는 예전에 낮은 온도에서 1도 정도 뺀 온도에서 하라고 배웠었거든요.. >그런데, 검색해보니 낮은 온도에서 3도 올려서 잡아보라는 말도 있고... > >제가 40, 42도에서 해봤는데 크기가 다르게 나오더라구요. >sequence상에서는 product가 657bp 정도 나와야 하는데, 600bp 정도가 나왔어요.. > >어찌해야 할까요?? 답변 부탁드려요ㅠ_ㅠ > 42도에서 확인이 되셨다면 온도를 더 내리지 마시고 그 수준이나 그 이상으로 하시는게 좋을것 같네요. 사이즈의 차이가 발생해서 걱정하시는것 같은데....많이 확인해 보셨겠지만 유전자 sequence다시 한번 확인해 보시는게 좋을것 같네요. splicing에서 차이가 발생할 수도 있거든요. 그리고 온도 차이가 너무 많이 나면 제대로된 결과가 잘 안나올수도 있습니다. 프라이며 제작하는데 얼마 하지 않으니까 다시 제작하시는건 어떨런지요
    답변수정
    >안녕하세요~ >실험하다가 막히는 부분이 있어서 질문드립니다. > >PCR시, 두개의 primer Tm 값이 차이가 많이 날 때는 >annealing temperature를 어떻게 맞춰야 할까요? > >primer는 > > >f- aac att tct aac aaa tgt > > >r- agt cct ctt cgg tcc gag cct tct t 이구요. > >applied biosystems에 주문을 하였는데, data sheet에 Tm값이 써있지 않아요;;; >web에서 여러 싸이트에서 알아보면 >우선 forward는 36, 40, 46도 정도로 나오고, >reverse는 61, 68, 71도 정도로 나오더라구요.. > >이렇게 두 프라이머의 Tm값에 차이가 많이 나면 >annealing temperate를 어떻게 정해야하나요? > >낮은 온도부근에서 잡으면 될까요? >저는 예전에 낮은 온도에서 1도 정도 뺀 온도에서 하라고 배웠었거든요.. >그런데, 검색해보니 낮은 온도에서 3도 올려서 잡아보라는 말도 있고... > >제가 40, 42도에서 해봤는데 크기가 다르게 나오더라구요. >sequence상에서는 product가 657bp 정도 나와야 하는데, 600bp 정도가 나왔어요.. > >어찌해야 할까요?? 답변 부탁드려요ㅠ_ㅠ > 42도에서 확인이 되셨다면 온도를 더 내리지 마시고 그 수준이나 그 이상으로 하시는게 좋을것 같네요. 사이즈의 차이가 발생해서 걱정하시는것 같은데....많이 확인해 보셨겠지만 유전자 sequence다시 한번 확인해 보시는게 좋을것 같네요. splicing에서 차이가 발생할 수도 있거든요. 그리고 온도 차이가 너무 많이 나면 제대로된 결과가 잘 안나올수도 있습니다. 프라이며 제작하는데 얼마 하지 않으니까 다시 제작하시는건 어떨런지요
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