2009-11-28
org.kosen.entty.User@7e3dae43
이재일(lji1928)
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Capture antibody을 코팅하고 antigen을 올리고 다시 Detection antibody을 코팅한 후에 HRP-antibody로 발색하는 걸로 알고있는데 처음 ELISA 시험을 할려는 학생입니다.
교수님의 의뢰로 1차 antibody을 제작하였습니다. 생산된 Ab가 Polyclonal Antibody로 생산되었는데, 이 Ab하나로 Capture와 Detection antibody로 모두 사용이 가능한가요?
아는 선배님께서는 서로 다른 에피토프을 인지하는 다른 Ab가 있어야 실험이 가능하다고 말씀하시던데, 그럼 전 1차 Ab을 하나 더 만들어야하나요?
제가 저희 실험방에서 처음 하는거라 제대로 된 Methods도 없이 할려다 보니 실험을 하면서 막막해서 이렇게 글을 씁니다. 도와주시면 감사하겠습니다.
기초지식이 없이 할려고 하니까 어렵네요. 부탁드립니다 도와주세요.
- ELISA
- antibody
- Sandwich ELISA
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
서기원님의 답변
2009-11-30- 0
우선 샌드위치 일라이자 에서 detection 항체와 capture 항체의 epitope가 달라야 하는 것든 당연합니다. 면역학을 공부하셨으면 이해가 더 빠를텐데, monoclonal 항체는 하나의 epitope를 가지는데, 즉 항체가 결합할수 있는 부위가 한군데라는 의미죠.. 그래서 당연 하나의 부위에 두개의 항체가 붙을수는 없겠죠... 그래서 모노클로날 항체의 경우 epitope이 같으면 사용 불가 임니다.. 이것을 다른 의미로 해석하면 poyclonal antobody은 epitope을 크게 신경쓰지 않아도 된다는 의미임니다. 폴리클로날 항체는 epitope이 여러개 입니다.. (물론 항원성이 큰 몇개의 부분에 많을 비율을 차지하게 되지만). 그래서 당연히 영향을 덜받겠죠. 하지만 님의 실험에선 두가지 문제가 있습니다. 첫째, 님의 항체는 폴리 클로날이며 detection과 capture를 같은 항체로 사용한다고 했는데요 이것은 epitope가 여러개임은 분명하지만, 단지 같는 epitope를 가지는 항체가 여러개 있는 것이므로 의미상 같은 epotope를 가지는 모노클로날 항체를 사용하는 경우와 유사한 현상이 어느정도 일어난다고 볼수 있습니다. 그래서 이것은 경우에 따라 다른 결과를 얻습니다. 체크하고자 하는 항원의 농도, 항원의 항원성. 항원의 크기, 항원에 epitope의 수와 항체 형성 비율등 다양한 factor에 의해 영향을 받을수 있습니다. 이런경우 실험을 해보아서 결과를 보지 않고는 알수 없습니다. 둘째. 이것은 문제가 좀 큼니다. 님이 capture와 detection에 같은 소스의 항체를 사용하신다고 했는데, 예를 들어 님의 항체가 mouse에서 얻은 것이라면 실험중 detection항체와 결합할수 있는 HRP, AP, biotine 같는 물질 붙은 이차 항체를 사용하게 되는데. 그럼 다시 예를 들면 anti-mouse IgG HRP(goat)를 사용하게 됨니다. 그럼 이 항체는 님의 detection과 capture 항체를 구분하지 못하고 둘다에 대해서 결합하게 됨니다... 이렇게 되면 결과는 님께서 원하는 항원에 대한 값이 아니라 처음의 capture Ab와 항원과 결합한 detection Ab 의 결과가 혼합된 결과가 나오겠죠.. 따라서. detection과 capture Ab는 다른 동물로부터 얻은 것과 epitope이 다른 것을사용하는게 일반적임니다. -
답변
임채진님의 답변
2009-12-01- 0
항원에 따라 다를 수 있습니다. 항원을 단백질로 제작하셨다면 여러 epitope에 대한 항체가 존재하기 때문에 가능하고요.. 혹은 분자량이 작게 발현한 단백질이나 펩타이드로 만들었다면 쉽지 않습니다. 큰 단백질로 만드셨다 가정했을 때, capture Ab로는 그냥 IgG만을 사용하면 됩니다. 하지만 detection용으로 사용하기 위해서는 정제한 IgG의 일부를 biotinylation하면 됩니다. 이 후 Avidin-HRP로 detection하면 깨끗한 결과를 얻을 수 있겠지요.. 항체를 만들 때 사용한 항원이 어떠한지.. 단백질 분자량은 어떠한지.. 등의 정보를 알려주시면 좋겠네요~~ >Capture antibody을 코팅하고 antigen을 올리고 다시 Detection antibody을 코팅한 후에 HRP-antibody로 발색하는 걸로 알고있는데 처음 ELISA 시험을 할려는 학생입니다. >교수님의 의뢰로 1차 antibody을 제작하였습니다. 생산된 Ab가 Polyclonal Antibody로 생산되었는데, 이 Ab하나로 Capture와 Detection antibody로 모두 사용이 가능한가요? > >아는 선배님께서는 서로 다른 에피토프을 인지하는 다른 Ab가 있어야 실험이 가능하다고 말씀하시던데, 그럼 전 1차 Ab을 하나 더 만들어야하나요? > >제가 저희 실험방에서 처음 하는거라 제대로 된 Methods도 없이 할려다 보니 실험을 하면서 막막해서 이렇게 글을 씁니다. 도와주시면 감사하겠습니다. > >기초지식이 없이 할려고 하니까 어렵네요. 부탁드립니다 도와주세요.