2009-12-01
org.kosen.entty.User@97c82d6
임채진(kwcl)
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phospho Ab를 만들기위해 phospho peptide로 항체 만들어 normal,phospho peptide affinity resin으로 정제하였구요..
crude serum 상태에서 target 단백질 발현한 cell lysate 중에서 wt, ala mutation의 경우 wt만을 잡는 것은 확인했습니다. serum 상태이기때문에 kinsase w/, w/o 모두 detection 되었구요..
그런데 정제한 IgG를 가지고, kinase w/o, w/ 조건으로 in-vitro phosphorylation 후에 wb해보니 둘 다 signal이 잡히는 것입니다..
분명 정제 후 elisa에서는 normal peptide는 잡히지않고 phospho peptide만 잡혔거든요..
원인을 생각하다가..
혹시 발현한 target protein이 발현 과정에서 제 인산화 target sequence에 인산화가 되어 발현되어있을 수 있는지요?
아니면. 제가 만든 항체나 다른 조건에 문제가 있을 수 있는지 조언부탁드립니다.
- phospho Ab
- kinase
- western blot
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답변 1
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답변
신동욱님의 답변
2010-01-11- 0
>phospho Ab를 만들기위해 phospho peptide로 항체 만들어 normal,phospho peptide affinity resin으로 정제하였구요.. >crude serum 상태에서 target 단백질 발현한 cell lysate 중에서 wt, ala mutation의 경우 wt만을 잡는 것은 확인했습니다. serum 상태이기때문에 kinsase w/, w/o 모두 detection 되었구요.. >그런데 정제한 IgG를 가지고, kinase w/o, w/ 조건으로 in-vitro phosphorylation 후에 wb해보니 둘 다 signal이 잡히는 것입니다.. >분명 정제 후 elisa에서는 normal peptide는 잡히지않고 phospho peptide만 잡혔거든요.. >원인을 생각하다가.. >혹시 발현한 target protein이 발현 과정에서 제 인산화 target sequence에 인산화가 되어 발현되어있을 수 있는지요? >아니면. 제가 만든 항체나 다른 조건에 문제가 있을 수 있는지 조언부탁드립니다. > target 단백질 발현한 cell lysate 중에서 wt, ala mutation의 경우 wt만을 잡는 것은 확인했다고 하니, 정제한 phospho Ab를 사용하여 이 실험을 다시한번 진행하시면 판단하실 수 있을 것입니다. 어떤 이유에서인지 몰라도 간혹 in vitro phosphorylatoin을 할 경우, kinase w/o 조건에서도 잡히는 경우가 있을 수 있기 때문에, 세포에 과발현 시켜서 판단을 하는 게 고민하는 시간을 줄일 것으로 여겨집니다