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지식나눔

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protein A을 이용해서 IgG를 정제할려고 합니다. 도움이 필요합니다.

2009-12-17 org.kosen.entty.User@56a10a7f 이재일(lji1928)
  • 2
protein A을 이용하여 IgG를 정제시 protein A 5ml을 컬럼에 팩킹하여 실험을 할때 protein A가 붙잡을 수 있는 IgG양을 알수 있을까요? 5차까지 항원을 인젝한 토끼의 혈액에서 직접 정제를 할려고 합니다. 토끼의 혈액에는 보통 얼마의 IgG가 가 포함되어 있어서 Protein A 5ml로 혈액 10ml을 이용하여 정제하여도 IgG가 넘치게 들어가는 양이 아니겠죠? 제가 처음 하는거라 잘몰라서 도움을 요청합니다.
  • 정제
  • protein A
  • IgG
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답변 2
  • 답변

    서기원님의 답변

    2010-01-04
    • 0
    정상상태에서 Rabbit --- IgG --- (serum) 5 to 10 mg/mL 정도 되는데요.. immunization 이 되었으면.. 이보다는 조금더 증가하겠지만.. 많이 증가 하지는 않을껍니다.. 전체항체는 많이 변하지 않고 항원에 대한 specific IgG의 비율이 증가한다고 보시면 됨니다.. 하지만.. specific IgG의 양은 여러 factor에 의해 결정되는데요(예로 항원의 특성) 따라서 혈액내의 특이적 항체의 양을 정확히 알수 없죠... 다만, 꼭 알고 싶다면 ELISA 실험을 통해서. 상대 정량을 할수 있습니다. 물론 이 실험에서는 비교 대상인 control IgG가 필요합니다. (이미 농도를 알고 있는 항원 특이 항체, 보통 회사로 부터 구입해서 합니다.) 어쨋든.. protein G 혹은 A 로는 특이 항체는 순수 분리 정제 할수 없습니다. nomal IgG도 포함되니깐요. 그래서 진정한 의미에서는 모든 IgG를 분리할때 사용합니다. 그래서 IgG를 제외한 다른 serum factor를 제거하는 거죠. 물론 boosting를 여려번 한 시료이므로 대부분은 특이적 항체가 정제됨니다.. 따라서 특이적 항체 정제시에서 님처럼 많이 이용합니다.(많은 실험에서 특이적이지 않은 적은 양의 nomal IgG는 문제가 되지 않으므로) 하지만 필요 조건이 면역 유도가 rabbit서 잘 되었다는 가정에서 입니다. 면역 유도가 잘 되지 않아 특이 항체가 적으면 그 만큼 특이 항체 양이 적으니깐요. 님의 실험은 잘은 모르지만. 단순히 IgG를 정제(특이 항체와 nomal 항체 포함)를 하시는게 맞다면,, 위의 농도 개념해서 시작하시면 되고요 protein A 혹은 G 의 binding capacity는 파는 회사마다 제품마다 조금씩 다르니깐.. 님의 제품 디스크립트를 확인하고 사용하세요.. 예를 들면 amersham의 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 는 19mg/ml정도 네요.. 계산 해서 적당히 하시면 됩니다..
    답변수정
    정상상태에서 Rabbit --- IgG --- (serum) 5 to 10 mg/mL 정도 되는데요.. immunization 이 되었으면.. 이보다는 조금더 증가하겠지만.. 많이 증가 하지는 않을껍니다.. 전체항체는 많이 변하지 않고 항원에 대한 specific IgG의 비율이 증가한다고 보시면 됨니다.. 하지만.. specific IgG의 양은 여러 factor에 의해 결정되는데요(예로 항원의 특성) 따라서 혈액내의 특이적 항체의 양을 정확히 알수 없죠... 다만, 꼭 알고 싶다면 ELISA 실험을 통해서. 상대 정량을 할수 있습니다. 물론 이 실험에서는 비교 대상인 control IgG가 필요합니다. (이미 농도를 알고 있는 항원 특이 항체, 보통 회사로 부터 구입해서 합니다.) 어쨋든.. protein G 혹은 A 로는 특이 항체는 순수 분리 정제 할수 없습니다. nomal IgG도 포함되니깐요. 그래서 진정한 의미에서는 모든 IgG를 분리할때 사용합니다. 그래서 IgG를 제외한 다른 serum factor를 제거하는 거죠. 물론 boosting를 여려번 한 시료이므로 대부분은 특이적 항체가 정제됨니다.. 따라서 특이적 항체 정제시에서 님처럼 많이 이용합니다.(많은 실험에서 특이적이지 않은 적은 양의 nomal IgG는 문제가 되지 않으므로) 하지만 필요 조건이 면역 유도가 rabbit서 잘 되었다는 가정에서 입니다. 면역 유도가 잘 되지 않아 특이 항체가 적으면 그 만큼 특이 항체 양이 적으니깐요. 님의 실험은 잘은 모르지만. 단순히 IgG를 정제(특이 항체와 nomal 항체 포함)를 하시는게 맞다면,, 위의 농도 개념해서 시작하시면 되고요 protein A 혹은 G 의 binding capacity는 파는 회사마다 제품마다 조금씩 다르니깐.. 님의 제품 디스크립트를 확인하고 사용하세요.. 예를 들면 amersham의 Protein G Sepharose 4 Fast Flow 는 19mg/ml정도 네요.. 계산 해서 적당히 하시면 됩니다..
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  • 답변

    장성재님의 답변

    2010-01-04
    • 0
    윗분께서 잘 설명해주셨군요. antigen-immunized rabbit 혈청 중의 total IgG는 대략 < 10mg/mL 이라고 보시면 됩니다. 그리고, Protein A 또는 Protein G sepharose의 Total IgG capacity는 대략 15 ~ 30 mg/mL 이므로, 님께서 언급하신 5 mL의 Protein A resin을 이용하여 토끼 혈청 10 mL를 직접 정제하시는 것은 가능합니다. 단, 직접 혈청을 Protein A 또는 Protein G resin에 loading하실 때에는 혈청을 binding buffer를 사용하여 2 ~ 5 배 정도 희석하시고, 0.45 um filter로 filtering 하신 후 loading 하시는 편이 좋습니다. 또한, antigen-specific IgG를 분리하시기 위해서는 NHS-activated Sepharose 등을 이용하셔서 특이적인 항원을 resin에 결합시켜 제작한 antigen-conjugated resin을 이용하시면 됩니다. 좀더 자세한 사항은 GE Healthcare (Amersham Biosciences Co.) 홈페이지를 검색해보시길 바랍니다. >protein A을 이용하여 IgG를 정제시 protein A 5ml을 컬럼에 팩킹하여 실험을 할때 >protein A가 붙잡을 수 있는 IgG양을 알수 있을까요? > >5차까지 항원을 인젝한 토끼의 혈액에서 직접 정제를 할려고 합니다. >토끼의 혈액에는 보통 얼마의 IgG가 가 포함되어 있어서 > >Protein A 5ml로 혈액 10ml을 이용하여 정제하여도 IgG가 넘치게 들어가는 양이 아니겠죠? >제가 처음 하는거라 잘몰라서 도움을 요청합니다.
    답변수정
    윗분께서 잘 설명해주셨군요. antigen-immunized rabbit 혈청 중의 total IgG는 대략 < 10mg/mL 이라고 보시면 됩니다. 그리고, Protein A 또는 Protein G sepharose의 Total IgG capacity는 대략 15 ~ 30 mg/mL 이므로, 님께서 언급하신 5 mL의 Protein A resin을 이용하여 토끼 혈청 10 mL를 직접 정제하시는 것은 가능합니다. 단, 직접 혈청을 Protein A 또는 Protein G resin에 loading하실 때에는 혈청을 binding buffer를 사용하여 2 ~ 5 배 정도 희석하시고, 0.45 um filter로 filtering 하신 후 loading 하시는 편이 좋습니다. 또한, antigen-specific IgG를 분리하시기 위해서는 NHS-activated Sepharose 등을 이용하셔서 특이적인 항원을 resin에 결합시켜 제작한 antigen-conjugated resin을 이용하시면 됩니다. 좀더 자세한 사항은 GE Healthcare (Amersham Biosciences Co.) 홈페이지를 검색해보시길 바랍니다. >protein A을 이용하여 IgG를 정제시 protein A 5ml을 컬럼에 팩킹하여 실험을 할때 >protein A가 붙잡을 수 있는 IgG양을 알수 있을까요? > >5차까지 항원을 인젝한 토끼의 혈액에서 직접 정제를 할려고 합니다. >토끼의 혈액에는 보통 얼마의 IgG가 가 포함되어 있어서 > >Protein A 5ml로 혈액 10ml을 이용하여 정제하여도 IgG가 넘치게 들어가는 양이 아니겠죠? >제가 처음 하는거라 잘몰라서 도움을 요청합니다.
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