2010-01-08
org.kosen.entty.User@45a9820b
곽서영(rhkrtj)
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X-gal, ampicilin으로 selection된것을 mini-prep.하고있습니다.
그런데 계속 chromosomal DNA 크기가 5개를 따면 4개정도로 나오고 그중 하나는 플라스미드 DNA로 나오는데-이것도 enzyme cutting을 하면 빈벡터일 경우가 많습니다..
혹시나 해서 blue colony도 함께 해봤는데 blue는 확실히 plasmid DNA가 잘나왔습니다.
selection을 한다고 했는데 이건 완전... 머.. ㅜㅜ
white colony를 다 해봐야 알수있을정도에요ㅜㅜ
뭐가잘못됐는지.. ㅜ
어드바이스 좀 부탁드립니다.ㅜㅜ
- mini-prep
- colony
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DELETED님의 답변
2010-01-08- 0
> >X-gal, ampicilin으로 selection된것을 mini-prep.하고있습니다. >그런데 계속 chromosomal DNA 크기가 5개를 따면 4개정도로 나오고 그중 하나는 플라스미드 DNA로 나오는데-이것도 enzyme cutting을 하면 빈벡터일 경우가 많습니다.. >혹시나 해서 blue colony도 함께 해봤는데 blue는 확실히 plasmid DNA가 잘나왔습니다. >selection을 한다고 했는데 이건 완전... 머.. ㅜㅜ >white colony를 다 해봐야 알수있을정도에요ㅜㅜ >뭐가잘못됐는지.. ㅜ >어드바이스 좀 부탁드립니다.ㅜㅜ >RE: 질문을 잘 이해를 못하겠군요. chromosomal DNA는 무엇이죠? plasmid mini-prep한다는 말씀이신것같은데.. blue-white selection시 blue colony도 당연히 plamid를 가지고 있죠. cloning하시는 것이라면, white를 더 selection하셔야 겠죠.. -
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오용식님의 답변
2010-01-08- 0
> >X-gal, ampicilin으로 selection된것을 mini-prep.하고있습니다. >그런데 계속 chromosomal DNA 크기가 5개를 따면 4개정도로 나오고 그중 하나는 플라스미드 DNA로 나오는데-이것도 enzyme cutting을 하면 빈벡터일 경우가 많습니다.. >혹시나 해서 blue colony도 함께 해봤는데 blue는 확실히 plasmid DNA가 잘나왔습니다. >selection을 한다고 했는데 이건 완전... 머.. ㅜㅜ >white colony를 다 해봐야 알수있을정도에요ㅜㅜ >뭐가잘못됐는지.. ㅜ >어드바이스 좀 부탁드립니다.ㅜㅜ blue/white screening이 제대로 안이루어졌거나,,, competent cell이 오염되었거나.. 둘 중 하나 아닐까요?? blue/white screening이 잘 안되었다면... 처음 white colony로 나왔던 것을 다시 X-gal과 IPTG가 포함된 LB+AP plate에 picking을 해보면,, 어떤건 blue로 나오고 어떤건 white로 나오고 할꺼에요, 그 중 white 를 골라서 실험을 하시면 될 듯.. (단, IPTG와 X-gal이 골고루 도말될 수 있도록 신경을 쓰셔야합니다.. 골고루 도말되지 않으면,,,, blue가 white로 나타날 수 있습니다..) screening이 제대로 이루어졌는지, 안이루어졌는지는 positive를 관찰해보세요, ( 순수 vector만을 넣고 transformation..순수 vector는 제한효소 처리 같은 것을 거치지 않은...원상태의 vector..) positive는 모두 blue로 나타나야하는데.. 그렇지 않고 군데군데 white가 나타난다면, IPTG와 X-gal을 제대로 도말해주지 못했다는 것입니다.. 혹은, transformation 후에 냉장고에 넣어두었다가 관찰해보세요, 희미하게 blue인지 white인지 구분이 잘 안가던 놈들도 확실히 구분이 가능하게 됩니다.. 하지만,,, 시간이 조금 필요하다는거... competent cell이 오염된건지 알아보는건, 실험하면서 negative를 하나 잡아주면 쉽게 알수 있는것이니까... 실험하면서 negative를 하나 잡아주세요, (vector를 넣지 않고 transformation...) 제가 답변해드릴수 있는것은 이정도로...^^ -
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문동찬님의 답변
2010-01-08- 0
white colony를 20ul 멸균수에 희석하고 10ul는 pcr template로 사용하는데 pcr 하시기 전에 95도 10분 과정 넣어주고 cycle돌리면 균이 터져서 pcr 됩니다. primer는 incert product 용 사용하시면 되구요 보통 primix사용해서 합니다. screening하고 남은 균액을 키워서 stock하시고 사용하세요. -
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신동욱님의 답변
2010-01-08- 0
> >X-gal, ampicilin으로 selection된것을 mini-prep.하고있습니다. >그런데 계속 chromosomal DNA 크기가 5개를 따면 4개정도로 나오고 그중 하나는 플라스미드 DNA로 나오는데-이것도 enzyme cutting을 하면 빈벡터일 경우가 많습니다.. >혹시나 해서 blue colony도 함께 해봤는데 blue는 확실히 plasmid DNA가 잘나왔습니다. >selection을 한다고 했는데 이건 완전... 머.. ㅜㅜ >white colony를 다 해봐야 알수있을정도에요ㅜㅜ >뭐가잘못됐는지.. ㅜ >어드바이스 좀 부탁드립니다.ㅜㅜ 원인 : PCR등을 통해 얻은 DNA fragment가 깨끗하지 않고, Primer pair에 의한 100bp도 안되는 작은 fragment에 의해 오염이 된 것 같습니다. 이런 것들은 vector에도 쉽게 들어가서 white colony를 형성하게 됩니다. 즉, Insert를 Gel elution을 해서 오염을 제거하는 것이 중요합니다. Tip : Insert의 RE cut - EcoR I/BamH I 이고 (단, Insert에는 Not I site가 없어야 함), Vector의 Multiple cloning site - EcoR I/Not I/BamH I 이라면, Ligation을 한 후에, Not I을 처리하십시요 (Ligation buffer에 Restriction enzyme을 넣고 30 분 정도만 incubation하면 됨) ---> Insert가 들어간 vector는 Not I에 의해서 잘리지 않지만, Insert가 들어가지 않은 vector는 Not I에 의해서 잘리게 되어, E.Coli로 transformation시에 거의 들어가지 않습니다. Colony수는 적게 나타나나 거의 99%가 white colony가 될 것입니다. 이방법은 99%로 Positive Cloning Efficiency가 된답니다 ^.^ 이해가 안된다거나 궁금하시면 재질문을 해주세용... -
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서기원님의 답변
2010-01-11- 0
화이트 colony 가 insert 가 없는 경우는 종종 일어납니다. 그 비율이 어마나 되는 지에 따라서 상황이 달라지는데.. blue가 많이 뜨고 white 가 적게 뜬다면.. 클로닝 자체가 잘 안되는 경우 입니다. ligantion,vector 자체, template DNA 등등.. 예로, 만약 님이 T-vector를 사용해서 cloning을 하셨다면 insert DNA에 A -tailing이 되어야 되는데.. pfu pol을 사용하셨다면 될리가 없겠죠.. white colony의 비율이 높다면, 윗분 말처럼 다른 fragment DNA의 간섭이 있을수 있습니다. 어쨋든.. 많은 문제들이 있는데.. 이런건 본인이 공부하거나 혹은 옆에 유능한 사람의 도움을 받아야 될듯, 결과나 실험 과정, 사용 시약 등을 제데로 알지 못하면 답변들릴게 없습니다.. 그리고 확실한건 님께서.. DNA 정제를 잘 못하시는것 같습니다.. mini prep 시 genomic DNA 가 오염 되는 경우는, 약하게 일어나거나 종종 일어나긴 하지만, 원칙적으로는 일어나면 안됨니다.. kit이 잘못되었거나 님께서 실험을 잘못 하고 있을 가능성이 큼니다. sol 2, sol 3의 pH가 잘못되었거나, sol 2 와 sol 3 를 넣고 inverting을 세거나 voltexing하였을때, 원심 분리후 sup을 단백질 지꺼기가 들어거지 않게 조심해서 적당히 취해야 하는데 그렇게 하지 않았거나 듣등 여러 이유가 있습니다.. 다시 한번 실험 법등을 확인 해야 할거 같습니다.
급하게 써서 그랬나바요;^-^;; mini-prep할대 lysis time을 많이 주게 되면 cell이 가지고 있던 plasmid DNA뿐만 아니라 chromosomal DNA까지 뽑힐수가 있는습니다 그런데 white colony는 plasmid DNA를 가진 애들인디 왜 그 밴드만 보이는지 이해를 할 수 없어서요...blue colony를 해？던 이유는 버퍼가 잘못된건가 해서 해봤던 겁니다.