2010-01-14
org.kosen.entty.User@401ef76
이승규(sklee0125)
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His tag이 달린 insoluble한 단백질을 정제하고자 합니다.
His tag 방법 중에 고농도 urea 조건에서 pH를 조절하는 방법(Qiagen에)이 있던데요
고농도 Guanidine HCl에서 하는 방법을 없을까요?
정제 바로 직전 과정이 고농도 Guanidine HCl에서 cleavage하는 것입니다.
고농도 urea로 버퍼 교환 없이 바로 His tag정제를 하고 싶은데요.
경험이나 조언 부탁드립니다.
- His tag
- insoluble
- 단백질
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2010-01-14- 3
insoluble His-tagged recombinant protein을 정제할 때 가용화시키는 방법으로 8M Urea 또는 6M Guanidine-HCl을 lysis buffer로 사용하실 수 있습니다. Urea를 사용하는 경우가 좀더 mild denaturing condition이며, 목적하는 단백질이 막단백질 등의hydrophobicity가 큰 경우와 가용화를 쉽게 하기 원하신다면 6M GuHCl을 권장합니다. 단, Urea을 사용하는 경우에는 lysate를 직접 SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 발현량을 확인할 수 있으나, GuHCl을 사용하신 경우에는 침전이 발생하므로 dialysis나 GuHCl의 제거를 위해서 TCA 처리 등을 요합니다. 언급하신 것 처럼 Urea를 사용할 경우 elution 조건은 pH의 차이를 이용하며, GuHCl의 경우에는 Ni-NTA에 대한 6 X His의 competitor인 imidazole를 이용하는 것이 일반적입니다. Non-specific binding을 줄이기 위해서 초기 농도를 20 mM로 사용하시고, elution 조건에서는 >100 mM을 사용합니다. 자세한 내용은 Qiagen에서 제공하는 manual (handbook)을 참고하시길 바랍니다. >His tag이 달린 insoluble한 단백질을 정제하고자 합니다. > >His tag 방법 중에 고농도 urea 조건에서 pH를 조절하는 방법(Qiagen에)이 있던데요 >고농도 Guanidine HCl에서 하는 방법을 없을까요? > >정제 바로 직전 과정이 고농도 Guanidine HCl에서 cleavage하는 것입니다. >고농도 urea로 버퍼 교환 없이 바로 His tag정제를 하고 싶은데요. > >경험이나 조언 부탁드립니다. -
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DELETED님의 답변
2010-01-14- 0
>His tag이 달린 insoluble한 단백질을 정제하고자 합니다. > >His tag 방법 중에 고농도 urea 조건에서 pH를 조절하는 방법(Qiagen에)이 있던데요 >고농도 Guanidine HCl에서 하는 방법을 없을까요? > >정제 바로 직전 과정이 고농도 Guanidine HCl에서 cleavage하는 것입니다. >고농도 urea로 버퍼 교환 없이 바로 His tag정제를 하고 싶은데요. > >경험이나 조언 부탁드립니다. Re: 관련 protocol 첨부 합니다.