2010-01-28
org.kosen.entty.User@76827317
최미희(rainbow14)
- 3
protein 칩을 위해 실험중인 학생입니다.
간단한 클로닝과정을 말씀드리면,
- 칩상에서 elevater로 사용될 peptide와 원하는 타겟peptide를 PCR하여 product 획득
- T vecoter에서 확인
- double dizaion
- pET vector ligaion
- BL21에서 protein expression
을 시행하였습니다.
그런데 자꾸 inclusionbody가 생성됩니다.
그래서 배양하는 온도도 낮춰보고, IPTG 농도도 여러모로 조절하여보았습니다.
elevater로 사용되는 peptide만 protein expression시키면 soluble한 상태로 잘 정제가 됩니다. soluble한 상태로 정제하고 싶은데 어려움을 겪고 있습니다.
오늘 pET vector에 넣은 sample sequncing결과 T7ter로 밴드가 나오지 않는 다고 하네요..
좋은 조언 부탁드립니다.
- protien expression
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
이상후님의 답변
2010-01-29- 2
>protein 칩을 위해 실험중인 학생입니다. >간단한 클로닝과정을 말씀드리면, >- 칩상에서 elevater로 사용될 peptide와 원하는 타겟peptide를 PCR하여 product 획득 >- T vecoter에서 확인 >- double dizaion >- pET vector ligaion >- BL21에서 protein expression >을 시행하였습니다. >그런데 자꾸 inclusionbody가 생성됩니다. >그래서 배양하는 온도도 낮춰보고, IPTG 농도도 여러모로 조절하여보았습니다. >elevater로 사용되는 peptide만 protein expression시키면 soluble한 상태로 잘 정제가 됩니다. soluble한 상태로 정제하고 싶은데 어려움을 겪고 있습니다. >오늘 pET vector에 넣은 sample sequncing결과 T7ter로 밴드가 나오지 않는 다고 하네요.. >좋은 조언 부탁드립니다. > Expression시키려는 단백질의 종류에 따라 inclusion body가 많이 만들어 지는 것이 있고, 적게 만들어 지는 것이 있을거 같군요. 우선, inclusion body를 최대한 soluble하게 하려면 cell을 키울때 약 30~35'C에서 평소에 induction 하는 cell의 O.D.값보다 조금 낮은 O.D.에서 induction 하면 비교적 soluble한 단백질을 얻을 수 있습니다. 또한 근본적으로 발현시키는 host cell(또는 vector)을 바꾸시는 방법이 있겠습니다. Urea 로 preparation시에는 원심분리 rpm을 조금 높게 설정하면 clear한 protein을 얻을 수 있을 것으로 기대됩니다. 만약에 도저히 안될 경우 그대로 inclusion body를 가장 깨끗한 형태로 모은후에, 약 6-8M 정도의 guanidine chloride를 넣고 homogenizer로 protein을 부순후에 PBS buffer 에 dialysis하고난 단백질을 0.2% SDS 에 넣고 100;C에 중탕해 주면 solubility가 높아집니다. 도움이 되시길 바랍니다. -
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신동욱님의 답변
2010-01-31- 2
>protein 칩을 위해 실험중인 학생입니다. >간단한 클로닝과정을 말씀드리면, >- 칩상에서 elevater로 사용될 peptide와 원하는 타겟peptide를 PCR하여 product 획득 >- T vecoter에서 확인 >- double dizaion >- pET vector ligaion >- BL21에서 protein expression >을 시행하였습니다. >그런데 자꾸 inclusion body가 생성됩니다. >그래서 배양하는 온도도 낮춰보고, IPTG 농도도 여러모로 조절하여보았습니다. >elevater로 사용되는 peptide만 protein expression시키면 soluble한 상태로 잘 정제가 됩니다. soluble한 상태로 정제하고 싶은데 어려움을 겪고 있습니다. >오늘 pET vector에 넣은 sample sequncing결과 T7ter로 밴드가 나오지 않는 다고 하네요.. >좋은 조언 부탁드립니다. > 보통 peptide의 경우에는 inclusio body가 잘 형성이 되지 않습니다. 그런데, His tag vector의 경우 간혹 inclusion body 가 형성되는 경향이 있습니다. GST vector (pGEX vector)로 바꾸시는 시도도 해보시길 바랍니다.
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이동원님의 답변
2010-02-03- 0
>protein 칩을 위해 실험중인 학생입니다. >간단한 클로닝과정을 말씀드리면, >- 칩상에서 elevater로 사용될 peptide와 원하는 타겟peptide를 PCR하여 product 획득 >- T vecoter에서 확인 >- double dizaion >- pET vector ligaion >- BL21에서 protein expression >을 시행하였습니다. >그런데 자꾸 inclusionbody가 생성됩니다. >그래서 배양하는 온도도 낮춰보고, IPTG 농도도 여러모로 조절하여보았습니다. >elevater로 사용되는 peptide만 protein expression시키면 soluble한 상태로 잘 정제가 됩니다. soluble한 상태로 정제하고 싶은데 어려움을 겪고 있습니다. >오늘 pET vector에 넣은 sample sequncing결과 T7ter로 밴드가 나오지 않는 다고 하네요.. >좋은 조언 부탁드립니다. > 단백질이 자꾸 insoluble fraction으로 갈때는, 아래분들의 지적대로 culture온도를 15도까지도 낮추어 키워보고, IPTG의 농도를 낮추어 보는게 첫번째로 해야될 접근이구요. 이건 단백질의 folding 속도를 늦추어서 solubilize시키려는 시도이구요. 문제는 그래도 않될때(이럴 경우 많습니다ㅠㅠ)에는 우선 tag을 바꾸어 보셔야 됩니다. 6xhis, gst, trx, nus등이 있구요. mbp는 solubility 면에선 좋은데 지저분하게 딸려오는 contaminant가 많구요, nus의 경우는 soluble aggregates을 만드는 경우가 많은 것 같습니다. 보통의 경우 이러한 tag들을 앞뒤로 바꾸어 달아보면서 soluble한 construc을 찾구요. 그래도 않될경우 construct을 다시 디자인 합니다. codon optimize를 하거나 construct을 좀더 짧게 혹은 길게 만들지요. cytotoxic해보인다면(culture가 잘 않자라거나, harvest후 끈적하거나) e coli strain을 바꾸셔야 됩니다.
좋은 답변 감사합니다.^^