2010-05-26
org.kosen.entty.User@4d6015f8
이중기(ljk0913)
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유전자 클로닝시 벡터의 self ligation을 방지하고자 Alkaline phosphotase를 처리하여 dephosphorylation을 실행하였습니다.
허나 좋은 결과를 얻지 못하였습니다.
클로닝시 위와 같은 방법을 안하고 그냥 클로닝 작업해서 얻을 수는 있지만 좋은 결과와 테크닉을 익히고자 방법을 시도했지만 좋은 결과를 얻지 못하여 혹시 위의 방법을 이용하여 좋은 결과와 테크닉에 대한 실험적인 protocol을 가지신 연구원이 계시면 조언 부탁드립니다.
우선 제가 실험한 내용을 정리하자면 Vector를 제한효소로 자른후 phenol extraction하였구요 그 담에 alkaline phosphotase를 처리하여 activation한 후 enzyme Inactivation 하기 위해서 EDTA와 SDS가 들어간 버퍼를 넣어주고 65도씨의 열을 가하였습니다. 그 후 다시 phenol extraction을 하여 DNA를 다시 회수하였습니다.
위와 같은 방법을 하여 좋은 결과를 얻어보고자합니다.
- phosphatase
- self ligation
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
장다영님의 답변
2010-05-29- 0
>유전자 클로닝시 벡터의 self ligation을 방지하고자 Alkaline phosphotase를 처리하여 dephosphorylation을 실행하였습니다. >허나 좋은 결과를 얻지 못하였습니다. >클로닝시 위와 같은 방법을 안하고 그냥 클로닝 작업해서 얻을 수는 있지만 좋은 결과와 테크닉을 익히고자 방법을 시도했지만 좋은 결과를 얻지 못하여 혹시 위의 방법을 이용하여 좋은 결과와 테크닉에 대한 실험적인 protocol을 가지신 연구원이 계시면 조언 부탁드립니다. > >우선 제가 실험한 내용을 정리하자면 Vector를 제한효소로 자른후 phenol extraction하였구요 그 담에 alkaline phosphotase를 처리하여 activation한 후 enzyme Inactivation 하기 위해서 EDTA와 SDS가 들어간 버퍼를 넣어주고 65도씨의 열을 가하였습니다. 그 후 다시 phenol extraction을 하여 DNA를 다시 회수하였습니다. > >위와 같은 방법을 하여 좋은 결과를 얻어보고자합니다. > phenol extraction은 단백질을 제거하기 위한 step 이고 그 이후에 이어지는 ethanol precipitation 과정을 통해서 DNA 회수하셨을 것입니다. phenol extraction 과정에서 DNA의 손실이 많이 있었을 것 같습니다. 그것도 두번이나 하였으니... DNA vector를 enzyme으로 자르고 alkaline phosphatase를 처리한 후에 phenol extraction을 해주시지 않아도 됩니다. alkaline phosphatase 처리한후 heat inactivation을 하시고 ligation을 바로 하셔도 되고 low melting gel 을 이용해서 gel을 내린후에 원하는 밴드만 잘라서 gel extraction을 하여 DNA를 회수하여 ligation을 하셔도 됩니다 좋은 결과 있으시길 바랍니다.