2010-06-03
org.kosen.entty.User@587c9065
김정환(mark1130)
- 2
얼마전까지 잘만 되던 wester blot이 몇일전부터 전혀 안되고 있습니다.
첫번째로 의심이 가는점은
transfer가 너무 빨리 된다는 것입니다.
trasfer buffer를 새로 만들어서 4도씨에 보관하던 버퍼를 사용하는데
400mA 로 약 25분이면 maker가 전부 넘어갑니다.
넘어간 membrane을 primary antibody와 secondary antibody 를 각각 처리해서 발색해보면
전혀 밴드가 나타나질 않습니다.
예전 실험할떄는 tranfer시간도 400mA로 걸었을때 약 40분정도 걸렸었는데
무슨 문제인지 tranfer가 빨라지면서 blot 자체가 되질 않습니다.
transfer 후에 남은 SDS gel을 염색해보면 분명 밴드는 보이지 않습니다.
gel에 밴드가 남아있지 않은것으로 보아 membrane으로 넘어간것 같은데 항체 처리를 하면
band가 나타나질 않습니다.
transfer buffer조성은
25mM tris, 192mM glycine, 20% MeOH, 0.1% SDS입니다.
얼마전 이 조성으로 transfer 했을때에는 별문제없이 잘됬는데
어느순간부터 잘 안됩니다.
우선 첫번째로 궁금한점은 transfer의 시간이 빨라진 이유에 대해 알고 싶고
transfer가 안될수 있는 조건에 대해 알고 싶습니다.
혹시 이런 경헙이 있으시거나 문제점을 아시는 분은 코멘트 부탁드립니다.
- western blot
- transfer
- membrane
지식의 출발은 질문, 모든 지식의 완성은 답변!
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
-
답변
서기원님의 답변
2010-06-04- 0
ponceau S 로 블로킹전에.. 염색해서... 단백질 transfer여부를 직접 확인해 보는게 먼저 해야될꺼 같습니다.. 이시약은 인터넷이나.. molecular cloning 책에 나와요.. 블로킹 전에.. 단백질 이동 여부를 확인하는 시약입니다.. 그래야 단백질 transfer가 된건지 안된거지 확인이 되며, transfer의 문제인지 아니면.. 그다음 과정에서의 문제인지 알수 있어요.. 물론 이 시약도 염색시약이므로 코마시 처럼.. 염색할수 있는 한계점 양이 있으니. 적은 양의 단백질의 경우는 해보아야 알겠죠.. 있지만 안나올수도 있으니... 참고 되셨기를.. -
답변
김정환님의 답변
2010-06-04- 0
우선 답변 감사합니다. 물론 ponceaus S 시약을 이용해서 염색을 해봤었는데 tranfer가 되지 않은것을 확인했습니다. 그런데 문제는 marker는 membrane으로 모두 넘어갔다는 것입니다. transfer 조건에 문제가 있다면 marker 자체도 넘어가지 말아야 한다고 생각하는데 marker은 분명히 넘어갔고 단백질들만 넘어가지 않았습니다. 위에서도 이야기했지만 transfer 시간이 줄어들었다는 점이 가장 의심스러운데 왜 그러는지...어떻게 해결해야 하는지를 알고 싶습니다...ㅠ.ㅠ