2010-06-03
org.kosen.entty.User@befc556
김인규(kidarime)
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첨부파일
(실험목적)
- MDA-MB-231 cell에서 apoptosis로 인한 cell death를 보고자 Doxorubicin을
처리하여 apoptosis를 유도 후 형광현미경으로 관찰
(재료 및 실험관련)
- In Situ Cell Death Detection kit (Fluorescenin) ; Roche,
- Poly-L-lysine으로 코팅
- Fixation(4% Paraformaldehyde in PBS, pH 7.4) 1시간,
- Permeabilisation (0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate)은 -20℃에서
1분 & 4℃에서 19분간 incubation ; 보통 ice에서 2분간 하는데 온도를 급격히 떨어
뜨려야 해서 -20도에 뒀다가 냉장실에서 incubation 한거구요, 다른 cell을 가지고
잘 된 방법이라 이게 문제가 되었을거라 생각되진 않습니다.
(문제점)
GFP signal을 관찰하기 힘듦. 그 원인으로,
1. apoptosis 유도제로 사용한 doxorubicin이 붉은색을 띄는데 GFP파장영역을
덮어버린다?.
2. doxorubicin이 DNA double strand에 끼어 cell death를 일으키는데,
apoptosis로 DNA가 잘려지면 3'말단에 붙어야할 Nucleotide가 방해를 받아
GFP를 내지못한다?
(첨부파일관련)
Slide는 보시면 뭘 본건지 쉽게 아실거라 생각합니다. 분명 Doxorubicin 미처리한 샘플
에서는 DNase1처리하고 보면 GFP 관찰됩니다만(2번슬라이드), 3번슬라이드 부터 보시면 GFP필터에서 주황색으로 보여집니다. Chromatin condensation, fragmentation, blebbing도 관찰할 수 있으나 해당 cell에서 GFP를 못 보내요. 아직도 모르는 실험적인 실수가 있을까요?
DeadEnd™ Colorimetric TUNEL kit으로 바꾸거나, 다른 drug으로 같은 실험을 해보고
잘 관찰되면 apoptosis를 보려는 실험은 다른 방법을 이용할까... 고민중입니다.
고수님들의 한 수 부탁드립니다.
- TUNEL
- apoptosis
- In Situ Cell Death Detection
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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