2010-06-23
org.kosen.entty.User@65687e87
김정환(mark1130)
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제가 하는 실험은
재조합 단백질을 plate에 붙이고
그 재조합 단백질을 인식하는 primary antibody를 처리하고
primary antibody 를 인식하는 secondary antibody를 처리해서 최종적으로 발색시키는 방법으로 ELISA 실험을 하고 있습니다.
실험에 사용하고 있는 plate는 NUNC사에서 나온 plate를 사용하고 있구요
재조합 단백질을 농도별로 처리해서 어느농도부터 antibody가 인식을 하는지 알아볼려는 실험을 하고 있습니다.
재조합 단백질은 농도별로 각 well에 처리를 하고 4도씨에서 O/N으로 붙입니다.
그리고 washing하고 primary antibody 처리하고(1시간) washing, secondary antibody 처리(1시간)하고 washing, 최종적으로 pNPP 시약을 이용해서 발색을 한뒤 405nm에서 측정을 합니다.
그런데 여기서 문제가 무엇이냐하면
일반적인 protocol을 보면 발색시약을 넣고 30분 내지 길면 1시간 내에 발색이 완료된다고 합니다. 흡광의 수치로 보았을때 0.1~0.9 사이의 data가 나온다고 알고 있습니다.
그런데 제가 실험을 한뒤 흡광을 측정해보면
30분정도 발색후 측정값은 0.01~0.09사이로 나오고 발색 1시간 뒤에 다시 측정해보면
0.05~0.15 정도의 수치 밖에 나오지 않습니다.
물론 하루정도 있다가 측정을 하면 0.1~0.9 사이의 값이 나오긴 합니다.
원래 이렇게 발색이 늦을수도 있는건지 아니면 실험이 잘못？는지 모르겠어서 이렇게 글 남깁니다.
여기 저기 찾아보니 발색이 늦게 일어날경우 상온에서 발색 반응을 하지 말고 37도에서 반응시켜 보라고 하길래 해봤지만 역시 결과는 같았습니다.
교수님은 발색이 이렇게 늦게 일어날 리 없다며 이 방법 저방법 찾아보시라는데....
고수님들의 조언 부탁드립니다.
- ELISA
- pNPP
- 발색
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
이길수님의 답변
2010-06-24- 0
Positive & negative control이 없어서 판단하기 힘들지만 protocol이 정확하다면 sample과 1 & 2차 antibody의 농도를 차별을 두어 측정해 보심이 좋을 듯 합니다. 전체적으로 차이가 없다면 sample과 1차 antibody의 결합에 문제점이 있을 듯 합니다. 또한 하루 지난 후의 OD 값은 의미가 없을 것으로 생각됩니다. ELISA OD 값은 측정 대상에 따라 OD 값이 천차만별이므로 절대 비교대상으로 생각하는 것은 무리가 있을 것 같습니다.