2010-06-30
org.kosen.entty.User@20d76d8b
김방진(pado3607)
- 2
RT-PCR을 하기 위해 오래전부터 sample을 모아왔습니다.
워낙에 구하기 힘들샘플이고 해서 얻어질때 마다 조금씩 얼려 두었는데요
조직을 enzyme처리 하여 단일세포로 만든 후 PBS로 washing하고
그 팰랫을 -70도 냉동고에 보관하였습니다.
이제 그 샘플들을 가지고 RT-PCR을 하려고 하는데요.
보관한지 6개월정도 되었는데 RNA가 혹시라도 손상을 받지 않았나
의심스럽습니다. cDNA를 만들어야 하는데 샘플이 상태가 어떨지 불안해서요
질문
- 6개월정도 보관한 샘플을 PCR하는데 문제가 없을까요?
- 가장 안정적으로 보관하는 방법은 무엇입니까?(물론 cDNA로 만드는법 말구요)
- 여러선생님들의 경험상 아주 미량의 샘플로 부터 최대한 많은 cDNA를 얻을수 있는 방법은 어떤것이 있습니까?, 일단 invitrogen의 RNA mini kit을 구입해 두긴했는데 양이 워낙 적어서요(500,000 cell 이하)
- 감사합니다.
- sample
- real time PCR
- RT-PCR
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
박동현님의 답변
2010-06-30- 0
저는 장기간 보관을 위해서는 주로 RNA를 뽑아서 formamide에 녹여 보관하는 방법을 씁니다. 물론 증류수에 녹여 보관하는 것보다 ethanol precipitation으로 매번 formamide를 제거해야하는 번거로움은 있지만, 가장 안전한 방법입니다. mRNA를 분리해야하는 경우가 아니면, RNA prep은 여러가지 면에서 Trizol (Invitrogen)이 column을 사용하는 kit 제품보다 나은 듯합니다. -
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장성재님의 답변
2010-07-01- 0
cDNA를 제조하시는 데 별다른 문제가 없을 것으로 보입니다. 조직이 아니라 세포를 펠렛 상태로 확인하실 정도의 양으로 스톡을 하셨으니, Trizol 처리로 RNA를 뽑으신 후 RT-PCR을 통하여 충분히 원하시는 cDNA를 제조하실 수 있습니다. 조직을 protease 처리하여 단일 세포로 분리하시는 과정에서 많은 세포들이 데미지를 받았을 것으로 생각이 됩니다만.... 아시다시피 RNA의 안정성을 생각하신다면 RNA를 뽑으신 후 RT 반응까지 완료하신 후 cDNA 상태에서 보관하시는 것이 가장 좋습니다. 아니면 조직을 직접 -80도 정도에서 보관하시는 것도 문제는 없을 것으로 보입니다. 님께서 취하신 방법도 cDNA를 제조하는 데는 문제가 없어 보입니다. >RT-PCR을 하기 위해 오래전부터 sample을 모아왔습니다. >워낙에 구하기 힘들샘플이고 해서 얻어질때 마다 조금씩 얼려 두었는데요 >조직을 enzyme처리 하여 단일세포로 만든 후 PBS로 washing하고 >그 팰랫을 -70도 냉동고에 보관하였습니다. >이제 그 샘플들을 가지고 RT-PCR을 하려고 하는데요. >보관한지 6개월정도 되었는데 RNA가 혹시라도 손상을 받지 않았나 >의심스럽습니다. cDNA를 만들어야 하는데 샘플이 상태가 어떨지 불안해서요 > >질문 > >- 6개월정도 보관한 샘플을 PCR하는데 문제가 없을까요? >- 가장 안정적으로 보관하는 방법은 무엇입니까?(물론 cDNA로 만드는법 말구요) >- 여러선생님들의 경험상 아주 미량의 샘플로 부터 최대한 많은 cDNA를 얻을수 있는 방법은 어떤것이 있습니까?, 일단 invitrogen의 RNA mini kit을 구입해 두긴했는데 양이 워낙 적어서요(500,000 cell 이하) >- 감사합니다.