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지식나눔

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blood에서의 FACS

2010-09-07 org.kosen.entty.User@50c6e870 장현희(petfrog)
  • 1
blood에서 RBC 제거 후,FITC- CD34(BD),E-VEGFR-2(KDR)(MACS)double positive를 FACS로 볼 예정입니다. cell counting,fix 과정과 Washing 과정 등 ？체적인 protocol이 없어서요.. FACS 하기 전 cell harvest 후, antibody 붙이는데 까지의 과정을 Lab에서 하고 있는 것 공유해 주세요..
  • FACS
  • protocol
  • Fixation
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답변 1
  • 답변

    장성재님의 답변

    2010-09-07
    • 2
    기본적으로 FACS를 이용한 분석을 위한 세포염색법은 다음과 같습니다. 1. cell harvest (trypsin-EDTA 또는 EDTA를 이용). 2. 2000rpm, 5 min 원심분리로 cell을 tube에 모은다. 3. Sup.을 제거한다. 4. 1 x PBS로 cell을 resuspension 한다. 5. Cell count를 수행한다. 6. 2000rpm, 5 min 원심분리로 cell을 down 시킨다. 7. PBS를 제거한다. 8. 차가운 1 x PBS를 첨가하여 cell을 한 번 washing 한다. 9. 2000rpm, 5 min 원심분리로 cell을 down 시킨다. 10. PBS를 제거한다. 11. 1x10^6 cell 당, 차가운 fixation buffer 1 ml을 첨가하고, ice에서 15~30 min incubation 한다. 12. 차가운 1 x PBS를 첨가하여 cell을 두 번 washing 한다. 원심분리기 사용 조건은 위에 설명한 바와 같다. 13. 1x10^6 cell 당, permeabilization buffer 1 ml을 첨가하고, ice에서 15 min incubation 한다 (세포막의 항원을 염색하기 위해서는 permeabilization은 생략 가능). 14. Cell을 down 시키고, 차가운 PBS로 두 번 washing 한다. 15. Fluorochrome-conjugated antibody로 cell을 staining 하고, RT, 1 h, 어두운 곳에서 incubation 한다. 16. Cell을 down 시키고, 차가운 PBS로 세 번 washing 한다. >blood에서 RBC 제거 후,FITC- CD34(BD),E-VEGFR-2(KDR)(MACS)double positive를 FACS로 볼 예정입니다. >cell counting,fix 과정과 Washing 과정 등 ？체적인 protocol이 없어서요.. >FACS 하기 전 cell harvest 후, antibody 붙이는데 까지의 과정을 Lab에서 >하고 있는 것 공유해 주세요..
    답변수정
    기본적으로 FACS를 이용한 분석을 위한 세포염색법은 다음과 같습니다. 1. cell harvest (trypsin-EDTA 또는 EDTA를 이용). 2. 2000rpm, 5 min 원심분리로 cell을 tube에 모은다. 3. Sup.을 제거한다. 4. 1 x PBS로 cell을 resuspension 한다. 5. Cell count를 수행한다. 6. 2000rpm, 5 min 원심분리로 cell을 down 시킨다. 7. PBS를 제거한다. 8. 차가운 1 x PBS를 첨가하여 cell을 한 번 washing 한다. 9. 2000rpm, 5 min 원심분리로 cell을 down 시킨다. 10. PBS를 제거한다. 11. 1x10^6 cell 당, 차가운 fixation buffer 1 ml을 첨가하고, ice에서 15~30 min incubation 한다. 12. 차가운 1 x PBS를 첨가하여 cell을 두 번 washing 한다. 원심분리기 사용 조건은 위에 설명한 바와 같다. 13. 1x10^6 cell 당, permeabilization buffer 1 ml을 첨가하고, ice에서 15 min incubation 한다 (세포막의 항원을 염색하기 위해서는 permeabilization은 생략 가능). 14. Cell을 down 시키고, 차가운 PBS로 두 번 washing 한다. 15. Fluorochrome-conjugated antibody로 cell을 staining 하고, RT, 1 h, 어두운 곳에서 incubation 한다. 16. Cell을 down 시키고, 차가운 PBS로 세 번 washing 한다. >blood에서 RBC 제거 후,FITC- CD34(BD),E-VEGFR-2(KDR)(MACS)double positive를 FACS로 볼 예정입니다. >cell counting,fix 과정과 Washing 과정 등 ？체적인 protocol이 없어서요.. >FACS 하기 전 cell harvest 후, antibody 붙이는데 까지의 과정을 Lab에서 >하고 있는 것 공유해 주세요..
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