2010-09-27
org.kosen.entty.User@72e9803c
이현정(endeavor821)
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안녕하세요.
실험하다 궁금한 점이 있어 이렇게 글 올립니다.
제가 현재 여러 종류의 stem cell을 이용해 hepatocyte로 분화를 유도한 다음
분화가 제대로 이루어졌는지 확인하기위해 urea assay를 진행하는데요.
실험결과가 예상과는 다르게 반대로 나와서 글 올립니다.
분화 전, 후 각 세포의 urea 농도를 측정해봤는데 분화 전 상태인 naive한 세포에서
urea 농도가 분화 후보다 높게 나왔습니다.
게다가 더 이상한 건 세포배양에 사용되는 배지에서도 urea 농도가 꽤 높게 나오는데
뭐가 문제인지 잘 모르겠어요.
현재 제가 분석한 바로는, 세포 배양시 첨가된 FBS 농도가 한 세포의 경우만 10%가 아닌 20% FBS를 사용하는데 결과를 보니 FBS 농도가 높을수록 흡광도 값이 높더라구요.
결과를 당최 어떻게 분석해야 할지 모르겠습니다.
현재 문제점을 간략하게 정리하자면,
1. 세포 배양에 사용되는 Basal media가 다르고 첨가된 FBS 농도가 다르다.
2. 세포배양에 쓰이는 Control 배지(W/FBS)에서 Urea 농도가 높게 나온다.
3. hepatocyte로 분화 후보다 분화 전 naive한 상태에 Urea농도가 높게 나온다.
4. 실험방법
사용한 kit = QuantiChromTM Urea Assay Kit (DIUR-500)
사용한 sample vol= 50ul (세포뱅양 후 상층액을 모은 것을 사용함)
- standard = stock 50mg/dL 를 1/10 dilution 하여 5mg/dL를 사용함
- Reaction buffer 200ul에 첨가 후 상온 50min 반응
- 흡광도 430nm에서 측정
(protocol 상 urea 농도가 낮을 경우 reaction을 20분에서 50분으로 늘리고 430nm에서 측정하라고 언급함)
혹, 실험 해보셨거나 같은 경험이 있으셨던 분 중에서 해결책을 알고 계신분은 답변 부탁 드립니다.
내일 다시 실험할 계획인데요,
sample vol과 incubation 시간을 15분으로 줄이고 파장을 520nm로 바꿔 볼 생각입니다.
이외에 더 좋은 방법이 있으신 분은 답변 꼭 부탁 드립니다.
참... 다른 한편으로는 분화가 안됐다고 볼 수도 있을 것 같은데요,
이 실험만 단독으로 진행한게 아니라 다른 부수적인 실험을 해봤는데 분화는 된 것으로
결과 나왔습니다.
그래서 더 답답하다는... 암튼 빠른 답변 부탁 드려요.
그럼 편안한 저녁 되세요
- Urea assay
- hepatocyte
- Differentiation
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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