2010-10-15
org.kosen.entty.User@58a0b391
노정란(ggoljji1)
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안녕하세요,
ELISA kit를 사용해서 인슐린을 측정해 온 학생입니다.
그런데 이번에 저희 랩에서 kit말고 직접 코팅부터 세팅을 하려고 하는데요.
제가 가지고 있는 시약이,
1)Mouse anti insullin pure (clone:2D11-H5)-100ug (capture)
2)Mouse anti insulin pure (clone:E2-E3)-100ug (detection)
3)Goat anti Mouse Ig HRP-1ml
4)TMB 이렇게 4가지 입니다.
제가 궁금한 사항은,
보통 일반적인 프로토콜은 2nd Ab에 biotin을 붙이고 여기에 avidin-HRP를
붙여 발색을 시키는데요,인슐린의 경우 2nd Ab에 biotin이 붙은 것이
없다고 합니다. 그래서 저렇게 4가지 조합으로 세팅을 해보려고 하는데요.
저처럼 direct로 HRP를 붙였을 때 sensitivity가 어떨까요?
그리고 이런 경우 총 3가지 Ab가 사용되는데 이러한 Ab의 농도는 얼마가 적당할까요?
그리고 제가 하려는 protocol이 맞는지 한번 봐주세요,
1) capture Ab로 coating 4도 overnight
2) wasihg
3) blocking 5% skim milk
4) washing
5) sample (plasma)
6) washing
7) detection
8) washing
9) goat anti mouse Ig HRP
10) washing
11) TMB
- ELISA
- insulin
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답변 2
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답변
손용규님의 답변
2010-10-17- 0
Abcam사에서 anti-insulin ab (biotin conjugated)를 판매하고 있네요. 상기 방법에서 IgG로 detection하는 방법은 실제 signal이 나오더라도 전혀 신뢰할 수 없습니다. coating하신 insulin항체와는 결합하지 않고 decction 항체인 IgG에 anti-mouse IgG HRP가 specific하게 binding하지 않습니다. 즉 원하는 detection Ab와 HRP항체간의 결합외에 coating한 Ab와 HRP간의 결합가능성이 매우 농후 합니다. detection항체에 histidine등이 tagging되어 있으면 anti-his Ab등으로 처리하는 방법외 상기 기술한 항체를 사용해 보시는 편이 좋을 것 같네요. -
답변
서기원님의 답변
2010-10-20- 0
윗분 말이 맞습니다.. capture 와 detection 항체가 같은 source의 것을 사용하면 안됨니다. 서로 다른 host로 부터 유래한 항체 사용해야 함니다. 그리고 biotin과 avidin을 사용하는 것은 signal 증폭이 가장큰 이유인데.. 워낙 소량이 아니라면 그냥 HRP 발색만으로도 실제론 충분히 강합니다.. ... 왠만하면 문제가 되지 않을듯 싶습니다만, 실험마다 다르니. 확답은 못드립니다.. 우선 위에 문제 해결하시고 일단 실험 진행 해보고 결과에 따라 다시 선택하심이 낳을듯..
저는 마우스 혈장에서 인슐린을 측정하고 있습니다. Abcam에서 판매하는 인슐린 항체는 human 용으로 알고 있는데요,,, 혹시 마우스 용 인가요? 만약 아시면 카달로그 번호라도 알려주실수 있을까요? 답변 매우 감사드립니다.