2010-12-08
org.kosen.entty.User@69a35186
강민철(kmcknight)
- 3
이제 대학원으로 진학하는 실험 초짜입니다.
다름이 아니라 실험을 하는데
지금 현재 T cell을 중심적으로 하는데
Macrophage와 Dendritic cell 또한 보고 싶어서입니다.
T cell은 CD4 이용하여 비드로 골라내는데 Macrophage와 Dendritic cell은
어떤식으로 뽑아내야하나요? 좀 도와 주십시요~
한가지 더 궁금한거는 osteoclast를 조직적으로 immunestaing을 할 때 무엇을 이용하여 봐야할까요/???ㅠ
- macrophage
- dendritic cell
- sorting
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 3
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답변
이상후님의 답변
2010-12-09- 2
>이제 대학원으로 진학하는 실험 초짜입니다. > >다름이 아니라 실험을 하는데 > >지금 현재 T cell을 중심적으로 하는데 > >Macrophage와 Dendritic cell 또한 보고 싶어서입니다. > >T cell은 CD4 이용하여 비드로 골라내는데 Macrophage와 Dendritic cell은 > >어떤식으로 뽑아내야하나요? 좀 도와 주십시요~ > >한가지 더 궁금한거는 osteoclast를 조직적으로 immunestaing을 할 때 무엇을 이용하여 봐야할까요/???ㅠ 고전적인 방법을 하나 알려드립니다. 1) Blood를 PBS나 HBSS(실온에 둔것)로 1:1 dilution시킴. 2) ficoll-hypaque를 15ml falcon tube에 담고 동량의 dilution된 혈액을 mixing. 3) 2000rpm, 20분간 실온에서 centrifugation. 4) 가장 아랫층에 RBC와 neutrophil이, 중간층에 monocytes가, 맨위층에 platelet, plasma로 층으로 분리됨. 5) macrophage는 중간 monocytes 층에 T, B cell, NK cell 등과 함께 존재 6) plasma를 어느정도 제거한 후, micropippet 끝 부분을 monocytes 층에 넣고 분리시킴. 7) 분리한 층에 buffer을 넣고 2회 정도 washing. 8) 다른 세포들과의 분리를 위해서는, 바닦에 달라 붙은 macrophage성질을 이용해서(다른 세포들은 suspension함), 앞서 분리한 monocytes cell pellet을 complete culture media로 resuspension한 후, culture flask나 culture dish에 담고 37'C, CO2 incubator내에서 1시간 정도 부착시킨후, media를 제거하고, PBS로 dish를 washing한 후 tyrpsin으로 바닥에 붙어 있는 macrophage만 분리 하면 됨. 9)분리된 macrophage 확인은 FACS로 purity를 측정. 그런데 이 방법은 실험자의 손기술에 따라서 purity가 문제가 될 수 있습니다. 가장 확실한 방법은 분리 kit를 사서 하는 편이 제일 좋은 방법입니다. -
답변
오현주님의 답변
2010-12-17- 2
그것보다 더 쉬운 방법은 acetic acid로 세번 pipetting하고 난 후 나머지 트리판블루 용액으로 카운팅해서 본 후 피콜을 이용하여 실험을 진행하여도 됩니다. >이제 대학원으로 진학하는 실험 초짜입니다. > >다름이 아니라 실험을 하는데 > >지금 현재 T cell을 중심적으로 하는데 > >Macrophage와 Dendritic cell 또한 보고 싶어서입니다. > >T cell은 CD4 이용하여 비드로 골라내는데 Macrophage와 Dendritic cell은 > >어떤식으로 뽑아내야하나요? 좀 도와 주십시요~ > >한가지 더 궁금한거는 osteoclast를 조직적으로 immunestaing을 할 때 무엇을 이용하여 봐야할까요/???ㅠ -
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김동현님의 답변
2010-12-10- 0
(단순히 숫자를 알고 싶은 경우라면) 각각의 특이 marker에 대한 항체를 이용하여 Flow cytometry 분석 (분리하여 assay를 진행할 계획이라면) T cell을 MACS로 분리해보신 경험이 있으시다면, Macrophage와 Dendritic cell 또한 MACS를 사용해보는 것은 어떠실런지요? http://www.miltenyibiotec.com/ 에서 monocyte, dendritic cell과 관련된 부분을 참고하시길 바랍니다. 또는 FACS sorter를 사용하는 것도 하나의 방법입니다. >이제 대학원으로 진학하는 실험 초짜입니다. > >다름이 아니라 실험을 하는데 > >지금 현재 T cell을 중심적으로 하는데 > >Macrophage와 Dendritic cell 또한 보고 싶어서입니다. > >T cell은 CD4 이용하여 비드로 골라내는데 Macrophage와 Dendritic cell은 > >어떤식으로 뽑아내야하나요? 좀 도와 주십시요~ > >한가지 더 궁금한거는 osteoclast를 조직적으로 immunestaing을 할 때 무엇을 이용하여 봐야할까요/???ㅠ
저기요....마지막줄에 분리 kit 라고 하셨는데~ 추천좀 부탁드립니다. 문외한이라서...ㅠ