2010-12-23
org.kosen.entty.User@5ca5c1af
이상욱(swlee9363)
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첨부파일
아래 첨부한 데이터는 Blank 입니다,
wates사의 XBridge Shield RP 18 (150*2.1, 3.5um) 를 사용하였고,
이동상으로는 A : 10mM NH4HCO3(pH9) : ACN (95:5)
B: ACN
20분 이후부터는 ACN%가 높아지는 Gradient 조건입니다.
ACN 을 Injection 하였을 때 이런 비슷한 데이터를 얻었습니다,
그래서 어떤 Solvent 도 Injection 을 하지 않은 채 얻은 data 가 첨부한 data입니다,
어떤 Solvent 도 Injection 을 하지 않았는데 이렇게 peak 처럼 나온다면,
Injetor 오염은 아니라고 생각하지만 , 분리하여서 wash 도 하였으나,
같은 결과였습니다.
물론 Column 은 새거입니다.
그리고, column 을 빼고 대신 Union 을 사용하여 DW 와 ACN으로 충분히 Cell 쪽을 wash 해보았지만 역시 같은 결과입니다.
조언 부탁드립니다.
- HPLC
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 2
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답변
조윤환님의 답변
2010-12-23- 0
올바른 방법으로 모든 오염 가능 부위를 점검하셨다면 컬럼이 문제로 추측됩니다. 기존에 문제 없이 사용했던 컬럼이 있다면 교체 후 같은 이동상으로 돌려서 같은 현상이 일어나는지 확인되면 확실히 컬럼의 문제 입니다. 컬럼이 새것이라고 하셨는데 완충액 이동상을 사용하시기 전에 정확한 방법으로 세척한 다음 equilibration 해서 사용하셨는지 모르겠네요. Waters사의 XBridge Shield 컬럼은 사용하신 이동상처럼 높은 pH에도 강한 내성을 가지도록 특별한 입자와 리간드 결합구조기술을 적용한 컬럼입니다. 컬럼은 포장상태에서 최초 사용하기전에 세척을 해야하며 이러한 방법은 컬럼의 특성에 따라 다릅니다. 이는 컬럼 보관 방법과도 밀점한 관련이 있으므로 컬럼이 새것이고 사용한 경험이 없다면 컬럼 매뉴얼을 꼼꼼히 읽어보고 사용하셔야 합니다. 심한 경우엔 처음 사용시 조치를 잘못해서 사용할 수 없는 상태가 되는 경우도 있습니다. 저도 멀쩡한 컬럼을 해먹은 적이 있습니다...... 사고친 후엔 몰래 묻어버리긴 했지만요... 일단 XBrige 컬럼은 100% 유기용매로 세척한 후에 이동상 조성에서 염을 제외한 용액으로 equilibration 시킨 후 완충용액을 사용하시면 됩니다. 새것을 바로 장착해서 완충용액으로 돌릴 경우 이동상의 조성에 따라 다르겠지만 염이 석출되어 컬럼이 재기 불능 상태가 될 수 있습니다. 최초 세척과 equilibration 등의 조치는 염 석출을 예방하기 위한 조치 입니다. 컬럼 내에 염이 석출되면 컬럼이 완전히 망가지니까요. 때문에 유기용매 --> 완충액 또는 완충액 ---> 유기용매로 변경할 땐 항상 물/유기용매 혼합액으로 equilibration을 거쳐서 변경하도록 하셔야 합니다. 오염의 문제라면 어느 곳 하나도 빼놓고 지나치지 마시고 하나씩 점검하셔야 합니다. -
답변
이상후님의 답변
2010-12-24- 0
>아래 첨부한 데이터는 Blank 입니다, > >wates사의 XBridge Shield RP 18 (150*2.1, 3.5um) 를 사용하였고, > > >이동상으로는 A : 10mM NH4HCO3(pH9) : ACN (95:5) > B: ACN > >20분 이후부터는 ACN%가 높아지는 Gradient 조건입니다. > >ACN 을 Injection 하였을 때 이런 비슷한 데이터를 얻었습니다, >그래서 어떤 Solvent 도 Injection 을 하지 않은 채 얻은 data 가 첨부한 data입니다, > >어떤 Solvent 도 Injection 을 하지 않았는데 이렇게 peak 처럼 나온다면, > >Injetor 오염은 아니라고 생각하지만 , 분리하여서 wash 도 하였으나, >같은 결과였습니다. > >물론 Column 은 새거입니다. > >그리고, column 을 빼고 대신 Union 을 사용하여 DW 와 ACN으로 충분히 Cell 쪽을 wash 해보았지만 역시 같은 결과입니다. > >조언 부탁드립니다. > 컬럼을 새 것을 사용하셨다면 컬럼의 오염은 아닐 가능성이 높습니다만, 초기 이동상 조성이 NH4CO3의 비율이 높은 것으로 보아서 NH4CO3가 contamination됐을 가능성도 있는데, 첨부 데이타를 보니 solvent cont.은 아닌거 같네요. HPLC에서 종종 문제되는 것이 컬럼이나 펌프 또는 detector 부분인데, 혹시 UV detector를 calibration 여부를 확인해 보셨는지요..보통은 6개월에 한번씩은 detector calibration을 해주는 것이 원칙인데 한 번 점검해볼 필요성이 있을 거 같습니다. 첨부 데이타의 y scale을 보니 단순 noise는 아닌 거 같고, 부가적으로 UV wavelength을 낮은 쪽으로 설정해서 체크해 볼 수도 있겠습니다.