2011-03-14
org.kosen.entty.User@b56d614
김동주(kimdongju77)
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s.spiroverticillatus 서열을 ncbi에서 확인 후 genomic dna에서 특정 polyketide 염기서열중 1.3kb정도를 증폭시키고자 forward primer는 enzyme site 두개 12mer 로 R 는 7개정도 서열을 추가로 부착하여 증폭하고자 하였으나 도저희 증폭이 되지 않습니다.
gradient pcr을 사용하여 45~65까지 test해봤고
버퍼나 dmso를 모두교채해보기도 하였으며 심지어 파이펫도 바꿔서 해보고
grnomic dna를 대량으로 모은 후pci 용액으로 다시 깨끗하개 정재해보기도 했습니다.
하도 답답해서 증폭하고자하는 서열 안쪽에 check primer 1kb 정도로 재작하여
test 해보았으나 역시나 증폭이 되지않았고 온도를 지나치게 낮춰서
pcr할경우 원하는 밴드가아닌 잡밴드가 보입니다. extaq rtaq 을 사용합니다.
어디서 제가 노치는 부분이 있을까요ㅠ
- pcr
- genomic DNA
- product
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변 1
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답변
박윤희님의 답변
2011-03-15- 0
>s.spiroverticillatus 서열을 ncbi에서 확인 후 genomic dna에서 특정 polyketide 염기서열중 1.3kb정도를 증폭시키고자 forward primer는 enzyme site 두개 12mer 로 R 는 7개정도 서열을 추가로 부착하여 증폭하고자 하였으나 도저희 증폭이 되지 않습니다. > >gradient pcr을 사용하여 45~65까지 test해봤고 > >버퍼나 dmso를 모두교채해보기도 하였으며 심지어 파이펫도 바꿔서 해보고 > >grnomic dna를 대량으로 모은 후pci 용액으로 다시 깨끗하개 정재해보기도 했습니다. > >하도 답답해서 증폭하고자하는 서열 안쪽에 check primer 1kb 정도로 재작하여 > > test 해보았으나 역시나 증폭이 되지않았고 온도를 지나치게 낮춰서 > >pcr할경우 원하는 밴드가아닌 잡밴드가 보입니다. extaq rtaq 을 사용합니다. > >어디서 제가 노치는 부분이 있을까요ㅠ 여러 가지 조건들을 바꾸어 봐도 반응이 일어나지 않는다면 가장 좋은 방법은 새로 프라이머를 짜는 방법뿐입니다. 간혹, Taq을 바꾸어 해보면 나오는 경우도 있지만.... 조건을 잡느라 고생하느니... 차라리 프라이머를 자시 짜는게 나을 것 같은데....
프라이머를 여러 검즘사이트를통해 검증해보앗고 in silico pcr ㅇ,ㄹ통해서 확인 해？ 는게 프라이너는 문제가 없다고 나옵니다ㅜ