2011-04-11
org.kosen.entty.User@57256dcc
김수희(iceblack)
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direct ELISA protocol를 사용하여 실험을 하려고 하는데
antigen을 깔고,
blocking를 사용한 다음,
결합하는 antibody를 반응시킨 다음,
substrate solution을 사용해야하는데
어떤 substrate solution을 사용해야할지 모르겠습니다.
맨처음 prealbumin from human plasma를 well에 깔고,
prealbumin goat olycolonal (reacts with Hu)으로 반응은 시켰는데
이걸 detection하기 위한 적절한 substrate solution이 무엇인지 모르겠습니다.
현재 TMBsoln으로 해보았는데 결과가 안나오더라구요.
그래서 제가 잘못 실험하고 있나 싶어서 문의드립니다.
- ELISA
- assay
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답변 2
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답변
장성재님의 답변
2011-04-11- 2
사용하신 1st Ab (antibody)에 사용하신 기질에 적합한 enzyme (TMB에 적합한 HRP)가 conjugation되어 있나요? 그렇지 않다면 HRP가 conjugation된 2nd Ab를 사용하셔야 합니다. 윗글에 적어놓으신 대로라면 효소가 없는 상태에서 기질만을 사용하여 반응하신 것이 될 것 같네요. direct assay를 위해서 enzyme conjugated 1st Ab를 사용하신 것이라면 어떤 enzyme이 conjugation된 것인지 정보를 주시면 적당한 기질을 알려드리겠습니다. >direct ELISA protocol를 사용하여 실험을 하려고 하는데 >antigen을 깔고, >blocking를 사용한 다음, >결합하는 antibody를 반응시킨 다음, > >substrate solution을 사용해야하는데 >어떤 substrate solution을 사용해야할지 모르겠습니다. >맨처음 prealbumin from human plasma를 well에 깔고, >prealbumin goat olycolonal (reacts with Hu)으로 반응은 시켰는데 >이걸 detection하기 위한 적절한 substrate solution이 무엇인지 모르겠습니다. >현재 TMBsoln으로 해보았는데 결과가 안나오더라구요. >그래서 제가 잘못 실험하고 있나 싶어서 문의드립니다. > -
답변
장성재님의 답변
2011-04-12- 0
direct ELISA와 Sandwich ELISA의 개념을 잘못 이해하고 계신 듯 하군요. 위 두 방법의 차이는 2nd Ab의 사용 유무가 아닌 단일한 항원에 대해서 각각 다른 종에서 얻어낸 (cross activity가 없는) 항체를 사용하여 하나는 바닥에 고정시켜주고 그 위에 항원을 붙이고 다음으로 또 하나의 항체를 반응시키는 방법이 sandwich ELISA 랍니다. 자세한 사항은 면역학 교과서를 참고하시거나 관련 웨사이트를 검색하시면 이해가 빠르실 겁니다. 당연히 enzyme-conjugated 2nd Ab를 사용해주셔야 합니다. >direct ELISA protocol를 사용하여 실험을 하려고 하는데 >antigen을 깔고, >blocking를 사용한 다음, >결합하는 antibody를 반응시킨 다음, > >substrate solution을 사용해야하는데 >어떤 substrate solution을 사용해야할지 모르겠습니다. >맨처음 prealbumin from human plasma를 well에 깔고, >prealbumin goat olycolonal (reacts with Hu)으로 반응은 시켰는데 >이걸 detection하기 위한 적절한 substrate solution이 무엇인지 모르겠습니다. >현재 TMBsoln으로 해보았는데 결과가 안나오더라구요. >그래서 제가 잘못 실험하고 있나 싶어서 문의드립니다. >
질문 답변 감사합니다. ㅠㅠ
enzyme이 conjugation되어있지 않습니다.
그럼, HRP가 conjugation되어있는 2nd ab를 사용해야하나요?
그렇게 되면 directELISA이기 보다는 sandwich ELISA가 되는것 아닌가요?
direct ELISA를 하려면 enzyme이 포함되어있는 1st ab로 반응을 해야하는건가요?