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>안녕하세요.. western blot을 하고 있는 대학원생 입니다.... > >다름이 아니라... 가장 기본이 되는 beta-actin을 하고 있습니다.. >beta-actin은 항상 일정하게 밴드가 형성되여야 한다고 알고 있습니다. >기본적인 다른 밴드들을 beta-actin으로 구하기 때문이라고도 알고 있습니다.. > >하지만.... beta-actin을 죽어라고 쳐봐도... 일정하게 뜨지를 않습니다.. >어디서 무엇이 잘못인지 모르겠습니다... > >처음에는 '이건 정량의 문제다'라고 생각했습니다. >아마도 전기영동시간이 너무길어서 단백질의 소실이 우려되고 그다음으로 양이 적은데서 오는 차이, >그래서 스탠다드커브부터 새롭게 그리고 sample protein의 정량도 3번에 걸쳐서 오차 범위까지 구했습니다. 하지만 오차범위는 거의 없는 것으로 나왔습니다. > >그런데도 실험결과가 계속 beta-actin이 일정하게 나오지 않았습니다.. >이유를 모르겠습니다... > >제가 실험한 프로토콜은 >1. 스탠다드커브는 99.6%이상 나옵니다.(595nm에서 측정하였고요, ELISA reader를 사용하였습니다. >2. 단백질 정량은 당연히 스탠다드커브구하듯이 측정하여 나온 측정값을 가지고 구했습니다. >3. gel 조성 (R 12%, S 5%) >4. sample제작은 10~15ug으로 만들었습니다. >5. 전기영동은 100V에서 3시간 30분 하였습니다. >6. Transfer는 80V, 1시간 30분 하였습니다. >7. Blocking(5% skim milk)을 하기 위해 membrane을 봤을 때 마커+샘플버퍼가 넘어간 것을 확인하였습니다. >8. Blocking은 상온에서 1시간 했습니다. >8. washing(TBS-T)10min*6 >9. primary antibody(beta-actin, 1:10,000) 냉장에서 overnight >10. primary antibody 상온에서 2시간 반응 >11. washing(TBS-T)5min*12 >12. secondary antibody 상온에서 1시간 반응 >13. washing(TBS-T) 5min*12 >14. ECL >15. 현상.. > >이런 방법으로 했는데 어떤게 문제 일까요... > >정말 답답합니다... >올해 들어와서 지금까지 이러고 있네요... > >여기저기 찾아봐도 제가 문제되고 있는 문제의 실마리를 찾지 못했습니다.. > >정말 이것저것 찾아가면서 다 해봤는데.. 이제는 정말 모르겠습니다... > >제가 띄운 밴드를 올리겠습니다... > >속시원한 답변을 얻고 싶습니다...ㅜㅜ > >그럼 오늘 하루도 힘내세요... > 전기영동 시간이 너무 긴것 같고요, 농도가 적은 편이고 또한 transfer하기전에 proceaus sol으로 확인하여 단백질이 transfer하기전에도 단백질의 패턴이나 양의 변화가 없는지 아님 , 3시간정도하엿으면 단백질의 소실도 예상되어짐

세포에 어떤 물질을 또한 어떤 조건으로 실험을 하셨는지 모르겠지만, 단백질 정량으로 얻은 값은 total cell lysate의 단백질량이므로 beta-actin은 차이를 보일 수도 있습니다. 아시다시피 beta-actin의 단백질 밴드는 총 단백질량으로 보정된 실험의 오차를 한번 더 보정하기 위한 reference로써의 의미를 가지는 것입니다. 세포에 처리한 물질 등에 의해 beta-actin이 변화를 보일 수도 있기 때문에 다른 reference로써 GAPDH 또는 다른 structural protein을 이용할 수 도 있습니다. 위에서 말씀하신 것 처럼 전기영동 시간이 너무 길고, 또한, 사진에서 확인해보면 beta-actin 밴드의 intensity가 바깥쪽에서 내부로 갈 수록 밴드가 옅어지는 것을 확인할 수 있는데,이는 transfer의 정도에 의한 것 일 수도 있습니다. 또한, 12번 정도씩 washing 과정을 과도하게 많이 진행하신 것도 좀 걸리는 부분이네요. 위의 사항들을 한번 체크해보시길 바랍니다.

보여주신 blot의 샘플들이 어떤 것들인지 알려주면 같이 생각해 보는데 도움이 될것 같네요.

일단 transfer 한후에 blot을 염색해서 염색이 sample별로 일정하게 되는지 확인하세요 blot을 염색하는 방법으로는 coumassie blue나 ponceau s solution등이 있습니다. coumassie로 염색하면 그 blot은 더이상 antibody로 staining할 수 없구요 ponceasu를 사용하면 염색 후 증류수로 씻어내면 염색이 없어집니다. 염색을 없앤 후에 계속 western을 진행할 수 있습니다. 염색해서 protein band들의 색깔이 일정한 진하기로 나오면 loading이 일정하게 된거고 그렇지 않으면 loading이 일정하지 않은거죠. 일반적으로 actin이 loading control로 쓰이긴 하지만 조건에 따라 발현이 달라지는 경우도 있으므로 주의해야 합니다.

>beta-actin을 죽어라고 쳐봐도... 일정하게 뜨지를 않습니다 -샘플의 총단백질량을 정량하여 로딩하고 트랜스퍼했다면 같은 전기영동 레인들의 베타-튜블린의 밴드가 어느정도 일정해야겠지요. -그런데 질문자의 밴드가 일정하지 않다는 말이 샘플당 튜블린 밴드 농도가 다르다는 것인지 다른 젤의 웨스턴 결과가 다르다는 것인지 모르겠습니다. -질문자의 문제가 밴드는 나오는데 그 밴드의 두께나 농도가 다르다는 것으로 이해하고(?) 제가 추천하는 체크 포인트는 아래와 같습니다. 1. 제일 먼저 추천하고 싶은 것은 다른 실험자 또는 실험실-웨스턴을 루틴하게 잘하고 있는-에 가서 부탁하여 본인의 샘플을 가지고 실험해보는 것입니다. 그 결과도 문제가 있다면 샘플의 문제거나 샘플의 준비과정이 문제겠죠. 2. transfer가 일정하게 항상 잘 되었는가? 다른 분들의 답변을 참조. 3. 시약들을 새로 만들어 웨스턴을 수행한다. 때로는 단순히 전기영동이나 웨스턴 시약의 문제일 수도 있더군요. 4. 베타-튜블린 항체를 다른 잘 되는 실험실의 것으로 바꾸어 같은 실험을 하여 비교 실험해 보세요. 5. 튜불린 항체가 너무 희석된다면 혹 가능성이 있으니 좀더 농축된 비율로 해보는 것도 한 방법일 것 같습니다. 이차항체도 좀 더 높은 농도로 하고... 그 이유는 때로 너무 오래된 것이거나 냉장고 고장 등으로 저장에 문제가 있어 항체도 단백질이라 변성이나 파괴가 되니 실제 활성이 낮을 수도 있지요. 그러면 항원-항체의 반응이 또는 발색반응이 포화 상태가 되지 않아 항원의 양보다 항체가 적다면 경우에 따라 적게 또는 많이 결합하여 결국 밴드 농도의 차이로 나올 수도 있으리라 봅니다. 6. 마지막으로 발색 시약도 점검해 보는 것이 한 방법으로 생각됩니다. 종합적으로 실험이 잘 않되면 항상 트러블슈팅이 문제인데 여러번 해보고도 해결이 안되었다니 가장 빠른 방법은 잘되는 실험실에 가서 그 실험실의 프로토콜과 시약으로 본인의 샘플을 실험해 보는 것이 가장 빠른 방법으로 생각됩니다. 그 후 본인의 실험 프로토콜이나 시약 등을 점검하는 것이 순서입니다. 이것을 추천하는 이유는 어쨌든 본인 샘플로 결과를 얻을 수 있기 때문입니다. -물론 다른 실험실에서 한 웨스턴이 잘 나온다는 전제가 있습니다만.- 무엇이 문제였던 당신은 당장 결과를 손에 쥘수 있지요. 교수는 결과를 원하지 무엇이 문제였는지는 덜 중요시 생각할 수도 있습니다. 그 후 천천히 해결할 수 있는 여유가 생기지요. 그럼 좋은 결과를 얻어 답글이 올라오기를 기원합니다. Good Luck!!! >안녕하세요.. western blot을 하고 있는 대학원생 입니다.... > >다름이 아니라... 가장 기본이 되는 beta-actin을 하고 있습니다.. >beta-actin은 항상 일정하게 밴드가 형성되여야 한다고 알고 있습니다. >기본적인 다른 밴드들을 beta-actin으로 구하기 때문이라고도 알고 있습니다.. > >하지만.... beta-actin을 죽어라고 쳐봐도... 일정하게 뜨지를 않습니다.. >어디서 무엇이 잘못인지 모르겠습니다... > >처음에는 '이건 정량의 문제다'라고 생각했습니다. >그래서 스탠다드커브부터 새롭게 그리고 sample protein의 정량도 3번에 걸쳐서 오차 범위까지 구했습니다. 하지만 오차범위는 거의 없는 것으로 나왔습니다. > >그런데도 실험결과가 계속 beta-actin이 일정하게 나오지 않았습니다.. >이유를 모르겠습니다... > >제가 실험한 프로토콜은 >1. 스탠다드커브는 99.6%이상 나옵니다.(595nm에서 측정하였고요, ELISA reader를 사용하였습니다. >2. 단백질 정량은 당연히 스탠다드커브구하듯이 측정하여 나온 측정값을 가지고 구했습니다. >3. gel 조성 (R 12%, S 5%) >4. sample제작은 10~15ug으로 만들었습니다. >5. 전기영동은 100V에서 3시간 30분 하였습니다. >6. Transfer는 80V, 1시간 30분 하였습니다. >7. Blocking(5% skim milk)을 하기 위해 membrane을 봤을 때 마커+샘플버퍼가 넘어간 것을 확인하였습니다. >8. Blocking은 상온에서 1시간 했습니다. >8. washing(TBS-T)10min*6 >9. primary antibody(beta-actin, 1:10,000) 냉장에서 overnight >10. primary antibody 상온에서 2시간 반응 >11. washing(TBS-T)5min*12 >12. secondary antibody 상온에서 1시간 반응 >13. washing(TBS-T) 5min*12 >14. ECL >15. 현상.. > >이런 방법으로 했는데 어떤게 문제 일까요... > >정말 답답합니다... >올해 들어와서 지금까지 이러고 있네요... > >여기저기 찾아봐도 제가 문제되고 있는 문제의 실마리를 찾지 못했습니다.. > >정말 이것저것 찾아가면서 다 해봤는데.. 이제는 정말 모르겠습니다... > >제가 띄운 밴드를 올리겠습니다... > >속시원한 답변을 얻고 싶습니다...ㅜㅜ > >그럼 오늘 하루도 힘내세요... >