2011-05-16
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종재은(jje8325)
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ChIP assay 하시는 분들 .. 제가 거의 1년째 실험이 안되서..
막막한 마음에 질문을 드리고자 합니다... 아시는 범위 내에서 답변 좀 부탁 드리겠습니다.
chip assay 과정에서 elution 후 reverse cross linking 하시구요
EtOH down 으로 뽑으시나요 ? 아니면 PCR purification 하시나요?
1) EtOH down 으로 뽑는 경우에는 rt-pcr 할 때마다 값은 제대로 나오시나요?
전 같은 샘플이라도 rt-pcr 할 때마다 계속 값이 달라져서..문제입니다.
혹시 저와 같은 경험 하신 분들은 어떤 단계가 문제이셨나요?
2) PCR purification kit로 뽑으시는 분들은..reverse crosslinking 후 바로 kit 사용하시나요?
RNase 먼저 하고 난 후 kit쓰시나요? 아니면 맨 마지막 단계에 RNase 처리하시나요?
저같은 경우에는 upstate 프로토콜에 따라 reverse crosslinking 후
대략 500 ul 정도의 볼륨이 됩니다.
저희 실험실은 PCR purification kit을 Q사 제품을 쓰는데요
프로토콜에 따르면 처음에 넣어주는 버퍼가 PB(5배에 해당하는 양)인데요
그럼 2.5ml의 PB 용액을 샘플과 섞어주고 칼럼에 로딩하시는지..
( 칼럼이 작다보니 여러번에 걸쳐 로딩해야 할 것 같은데 말이죠.).
아니면 PB 용액 첨가를 생략하시나요?
답변 부탁드리겠습니다 ....
- chip assay
- etoh down
- pcr purification
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각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
답변 2
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답변
이상열님의 답변
2011-05-21- 0
1) EtOH down 으로 뽑는 경우에는 rt-pcr 할 때마다 값은 제대로 나오시나요? 전 같은 샘플이라도 rt-pcr 할 때마다 계속 값이 달라져서..문제입니다. 혹시 저와 같은 경험 하신 분들은 어떤 단계가 문제이셨나요? -> 여기서 말하는 값의 차이란 무엇을 의미하는지요? 보통 3반복해서 통계처리를 합니다. 개개의 값차이를 말하는 건지 아님 fold ratio나 데타 CT값의 차이를 말하는 건지 알면 도움이 될 것 같습니다. 일반적으로 EtOH down을 해도 충분히 가능합니다. 2) PCR purification kit로 뽑으시는 분들은..reverse crosslinking 후 바로 kit 사용하시나요? 일단 RNase를 먼저 처리합니다. 저같은 경우에는 upstate 프로토콜에 따라 reverse crosslinking 후 대략 500 ul 정도의 볼륨이 됩니다. 저희 실험실은 PCR purification kit을 Q사 제품을 쓰는데요 프로토콜에 따르면 처음에 넣어주는 버퍼가 PB(5배에 해당하는 양)인데요 그럼 2.5ml의 PB 용액을 샘플과 섞어주고 칼럼에 로딩하시는지..( 칼럼이 작다보니 여러번에 걸쳐 로딩해야 할 것 같은데 말이죠.) 아니면 PB 용액 첨가를 생략하시나요? -> PB용액 첨가를 하지 않은 것을 추천드립니다. 그리고 여기서 양이 중요한 것이 아닙니다. PCR purification kit의 binding capacity가 중요합니다. 이 kit의 binding capacity는 10 ug입니다. 이보다 양이 많으면 나누어서 2개 혹은 3개 column을 사용하시고 이보다 적으면 하나의 column을 반복해서 사용하시면 됩니다. 혹시 더 필요하신 거 있으시면 이메일 주십시요... -
답변
김상태님의 답변
2011-06-14- 0
>ChIP assay 하시는 분들 .. 제가 거의 1년째 실험이 안되서.. > >막막한 마음에 질문을 드리고자 합니다... 아시는 범위 내에서 답변 좀 부탁 드리겠습니다. > >chip assay 과정에서 elution 후 reverse cross linking 하시구요 > >EtOH down 으로 뽑으시나요 ? 아니면 PCR purification 하시나요? > >1) EtOH down 으로 뽑는 경우에는 rt-pcr 할 때마다 값은 제대로 나오시나요? > >전 같은 샘플이라도 rt-pcr 할 때마다 계속 값이 달라져서..문제입니다. > >혹시 저와 같은 경험 하신 분들은 어떤 단계가 문제이셨나요? > >2) PCR purification kit로 뽑으시는 분들은..reverse crosslinking 후 바로 kit 사용하시나요? >먼저 IP를 한후 이를 농축하거나 정제후 브피를 줄이는 방법이나 P/C이나 칼럼에 첨가하여 dna를 회수후 RT-PCRGKA >RNase 먼저 하고 난 후 kit쓰시나요? 아니면 맨 마지막 단계에 RNase 처리하시나요? > >저같은 경우에는 upstate 프로토콜에 따라 reverse crosslinking 후 > >대략 500 ul 정도의 볼륨이 됩니다. > >저희 실험실은 PCR purification kit을 Q사 제품을 쓰는데요 > >프로토콜에 따르면 처음에 넣어주는 버퍼가 PB(5배에 해당하는 양)인데요 > >그럼 2.5ml의 PB 용액을 샘플과 섞어주고 칼럼에 로딩하시는지.. >( 칼럼이 작다보니 여러번에 걸쳐 로딩해야 할 것 같은데 말이죠.). >아니면 PB 용액 첨가를 생략하시나요? > >답변 부탁드리겠습니다 ....