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안녕하세요. 항체분석 따위(?)에 골머리 앓는 대학원생입니다ㅠㅠ
항체 분석을 하려 하는데, 컬럼을 연결하니까 압력이 4000 psi (x 1000)까지 뛰더군요. 하아...
(flow rate는 1.5 ml/min였습니다.)
poros사 컬럼인데, 재생이 가능 한지, HPLC고수님들의 조언을 부탁드리고 싶습니다.
평상시에는 포타슘 포스페이트 버퍼가 충진된 상태로 냉장보관을 해왔거든요. 이전에 오래된 컬럼이 하나 있었는데 그것 또한 그렇게 몇년을 썼었구요. 보관상태에 문제가 있었던 것일까요? 한두푼하는 컬럼도 아니고, 꼭 재생시키고 싶습니다...
- hplc
- protein a
- column
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
이상후님의 답변
2011-07-11- 2
-------------------------------------질문-------------------------------------
안녕하세요. 항체분석 따위(?)에 골머리 앓는 대학원생입니다ㅠㅠ
항체 분석을 하려 하는데, 컬럼을 연결하니까 압력이 4000 psi (x 1000)까지 뛰더군요. 하아...
(flow rate는 1.5 ml/min였습니다.)
poros사 컬럼인데, 재생이 가능 한지, HPLC고수님들의 조언을 부탁드리고 싶습니다.
평상시에는 포타슘 포스페이트 버퍼가 충진된 상태로 냉장보관을 해왔거든요. 이전에 오래된 컬럼이 하나 있었는데 그것 또한 그렇게 몇년을 썼었구요. 보관상태에 문제가 있었던 것일까요? 한두푼하는 컬럼도 아니고, 꼭 재생시키고 싶습니다...
아마도 변성된 단백질이나 lipids류가 강하게 결합되었을 가능성이 매우 높습니다. 이런 경우 일반적인 재생 방법으로는 용출되지 않습니다.
소수성 단백질과 당단백질 또는 지질류를 용출시키기 위해서는 비이온성 계면활성제(예를들어서 37'C로 컬럼 오븐 온도를 상승시키고, 0.1% Triton X-100 사용)1분동안 용출시켜 줍니다. 그런 후에 즉시 가장 보편적으로 사용하는 washing buffer(10 mM tris HCl, pH 7.4)를 컬럼 볼륨의 약 10배까지 흘려줍니다. 또한 침전되었거나 변성된 단백질류를 제거시키기 위해서는 6M guanidium HCl로 컬럼을 세척해 줍니다. 그런 후에 즉시, washing buffer(10 mM tris HCl, pH 7.4)를 컬럼 볼륨의 약 10배까지 흘려줍니다. 좀 더 자세한 방법은 첨부해 드리는 파일을 참고해 보세요..
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답변
조윤환님의 답변
2011-07-11- 0
일반적으로 상용 chromatography column에는 사용 설명서가 들어 있습니다.
그 사용 설명서에 보면 컬럼의 사용법, 보관방법, 세척방법이 나와 있습니다. 만약 설명서를 분실하셨다면 메이커 홈피에 들어가서 찾아 보시면 됩니다.
protein A column은 resin(Polystyrenedivinylbenzene)에 recombinant Protein A를 immobilization시킨 Affinity chromatography용 column입니다.
이러한 종류의 컬럼에서 압력 상승은 컬럼의 건강상태가 좋지 않다는 적신호 라고 생각하시면 됩니다. 제 경험상으론 세척을 해도 정상으로 돌아오기 힘듭니다. 하지만 고가의 컬럼을 그냥 포기할 순 없으니....노력은 해봐야겠죠.
컬럼의 수명은 얼마나 컬럼 관리에 주의를 기울였는가에 좌우됩니다. 뿐만 아니라 어떻게 사용했는가도 중요한 요인 중 하나죠.
예컨데.... 분석조건의 유속이 1.0 ml/min이라고 하면, 초심자의 경우 바로 1.0 ml/min로 유속을 설정하곤 합니다. 거의 자살행위죠.....유속의 갑작스런 변화는 컬럼입장에선 엄청난 충격이거든요.......
압력이 한번 올라가면..... 세척을 통해 어느 정도 개선할 수는 있어도 예전으로 완전히 되돌리기는 힘듭니다. 특히 유속을 한번에 올린 경우엔 더욱 그렇죠. 단계적으로 올릴 경우엔 컬럼에 큰 손상이 생기기 전에 미리 압력 상승을 알 수 있어 큰 손상을 피할 수 있게되죠.
세척해서 상태가 호전되기 기원합니다. 안된다면...... 비싼 교훈을 얻었다고 생각하셔야겠죠.
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안녕하세요. 항체분석 따위(?)에 골머리 앓는 대학원생입니다ㅠㅠ
항체 분석을 하려 하는데, 컬럼을 연결하니까 압력이 4000 psi (x 1000)까지 뛰더군요. 하아...
(flow rate는 1.5 ml/min였습니다.)
poros사 컬럼인데, 재생이 가능 한지, HPLC고수님들의 조언을 부탁드리고 싶습니다.
평상시에는 포타슘 포스페이트 버퍼가 충진된 상태로 냉장보관을 해왔거든요. 이전에 오래된 컬럼이 하나 있었는데 그것 또한 그렇게 몇년을 썼었구요. 보관상태에 문제가 있었던 것일까요? 한두푼하는 컬럼도 아니고, 꼭 재생시키고 싶습니다...