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안녕하세요. 도움을 얻고자 이렇게 글을 남깁니다.
제가 지금 human t cell을 가지고 실험을 하고 있습니다. PBMC를 분리한 다음 MACS kit를 이용해 pure한 CD4 T cell을 isolation했습니다.
이렇게 분리한 cell을 가지고 실험을 진행하고 있는데 아무래도 증식이 안되거나 너무 느리게 되는것 같아 이렇게 글을 올립니다.
현제 진행하고 있는 실험 방법은
96well plate에 cd3를 10ug/ml의 농도로 coating해 줍니다.
(이 때 cd3는 PBS에 섞어주며 well당 200ul씩 분주합니다.)
이렇게 CO2 incubator에서 2시간 동안 반응시킨 다음 상층액을 제거하고 CD28 2ug/ml과 IL-2 2ug/ml을 첨가하여 cell을 1x10^5으로 깔아줍니다.
참고로 media의 조성은
FBS : 10%
L-glutamine : 1%
antibiotics :１％
2-mercaptoethanol : 50uM
RPMI 1640 media입니다.
이런 방법으로 일단 setting하고 있느라 3일 5일 7일을 배양하고 있는데 사정상 증식정도를 cell count로 하고 있습니다.
그런데 count가 좀 이상합니다. 3일째는 약 3x10^5정도 나오고 5일째는 4.5~5x10^5이고 마지막 7일째는 5~6x10^5정도 밖에 count가 나오지 않습니다.
media는 2-3일 만에 한번 씩 갈아주고 있습니다. (media가 노랗게 변할 때마다)
갈아줄 때 마다 물론 뭉쳐있는 t cell을 suspension해준 다음 tube에 옮겨 원심분리해서 media를 제거해 주고 CD3는 이미 plate에 coating되어 있으니까 CD28과 IL-2를 위에서 언급한 농도로 다시 첨가해서 갈아주고 있습니다. 그러니까 5일째 harvast하는 well의 cell은 1번 , 마지막 7일째 harvast하는 well의 cell은 2번의 media change를 하는거죠.
제 생각으로는 cell이 너무 자라지 않는 것 같습니다. 적어도 2x10^6 이상은 충분히 넘게 나와야 한다고 생각합니다. 자극이 들어간 시점을 기준으로 24시간 이후부터 6시간에 1번꼴로 분열이 일어나는 것으로 알고있습니다.
현미경으로 보면 t cell이 많이 뭉쳐있는 걸로 봐서 자극은 문제가 없는 것 같습니다.
왜 이렇게 cell이 자라지 않는지 모르겠습니다. 제가 media를 갈아주는 시점에서 뭔가 문제가 생기는게 아닐까요? media를 갈아주고 나서 cell이 초반처럼 잘 뭉치지 않는다는 느낌이 들기는 하지만.......아니면 cd3 농도가 너무 높은 걸까요? 하지만 몇몇 논문에서도 cd3는 저 정도의 농도로 한 실험이 있더군요. t cell을 접해보신 분들의 조언을 구하고 싶습니다.
도와주시면 감사하겠습니다.
- t cell
- cd3
- cd28
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
강재성님의 답변
2011-07-26- 0
첨부파일을 한번 보시죠~
current protocol of immunology에 올라와 있는 것입니다.
-------------------------------------질문-------------------------------------
안녕하세요. 도움을 얻고자 이렇게 글을 남깁니다.
제가 지금 human t cell을 가지고 실험을 하고 있습니다. PBMC를 분리한 다음 MACS kit를 이용해 pure한 CD4 T cell을 isolation했습니다.
이렇게 분리한 cell을 가지고 실험을 진행하고 있는데 아무래도 증식이 안되거나 너무 느리게 되는것 같아 이렇게 글을 올립니다.
현제 진행하고 있는 실험 방법은96well plate에 cd3를 10ug/ml의 농도로 coating해 줍니다.
(이 때 cd3는 PBS에 섞어주며 well당 200ul씩 분주합니다.)
이렇게 CO2 incubator에서 2시간 동안 반응시킨 다음 상층액을 제거하고 CD28 2ug/ml과 IL-2 2ug/ml을 첨가하여 cell을 1x10^5으로 깔아줍니다.
참고로 media의 조성은
FBS : 10%
L-glutamine : 1%
antibiotics :１％
2-mercaptoethanol : 50uM
RPMI 1640 media입니다.
이런 방법으로 일단 setting하고 있느라 3일 5일 7일을 배양하고 있는데 사정상 증식정도를 cell count로 하고 있습니다.
그런데 count가 좀 이상합니다. 3일째는 약 3x10^5정도 나오고 5일째는 4.5~5x10^5이고 마지막 7일째는 5~6x10^5정도 밖에 count가 나오지 않습니다.
media는 2-3일 만에 한번 씩 갈아주고 있습니다. (media가 노랗게 변할 때마다)
갈아줄 때 마다 물론 뭉쳐있는 t cell을 suspension해준 다음 tube에 옮겨 원심분리해서 media를 제거해 주고 CD3는 이미 plate에 coating되어 있으니까 CD28과 IL-2를 위에서 언급한 농도로 다시 첨가해서 갈아주고 있습니다. 그러니까 5일째 harvast하는 well의 cell은 1번 , 마지막 7일째 harvast하는 well의 cell은 2번의 media change를 하는거죠.
제 생각으로는 cell이 너무 자라지 않는 것 같습니다. 적어도 2x10^6 이상은 충분히 넘게 나와야 한다고 생각합니다. 자극이 들어간 시점을 기준으로 24시간 이후부터 6시간에 1번꼴로 분열이 일어나는 것으로 알고있습니다.
현미경으로 보면 t cell이 많이 뭉쳐있는 걸로 봐서 자극은 문제가 없는 것 같습니다.
왜 이렇게 cell이 자라지 않는지 모르겠습니다. 제가 media를 갈아주는 시점에서 뭔가 문제가 생기는게 아닐까요? media를 갈아주고 나서 cell이 초반처럼 잘 뭉치지 않는다는 느낌이 들기는 하지만.......아니면 cd3 농도가 너무 높은 걸까요? 하지만 몇몇 논문에서도 cd3는 저 정도의 농도로 한 실험이 있더군요. t cell을 접해보신 분들의 조언을 구하고 싶습니다.
도와주시면 감사하겠습니다. -
답변
김재훈님의 답변
2011-07-28- 0
Northwestern University Medical SchoolByung S. Kim 교수님의 관련 회원님의 답변을 전달해 드립니다.What is 코너 담당자 김재훈 전달해 드림
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We usually titrate the optimal concentration of anti-CD23 to coat plates. Also, I am wondering whether you place any antigen presenting cells (feeder cells). Either purified macrophages or dendritic cells are often used. Good luck.
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답변
김재훈님의 답변
2011-07-28- 0
관련 분야 회원님의 답변을 전달해 드립니다.
What is 코너 담당자 김재훈 드림.
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저는
a-CD3(100ug/ml), 100ul 로 4도에서 overnight하구요.
a-CD28은 5ug/ml농도로 넣어줍니다.
DC같은 feeder cell을 넣어주면 더 좋겠지요.
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