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첨부파일
첨부한 파일은 HPLC 분석 data 입니다.
이동상A - 500mmol/l ammonium acetate:water:ACN=1:8:1
이동상B - 500mmol/l ammonium acetate:water:ACN=1:1:8
Gradient Time 0 15 40 50 50.1 60
%B 15 15 100 100 15 15
LC 조건은 위와 같은데요.
제가 원하는 peak는 8. 919min에 나오는 peak 이고,
36min~50min 사이에 나오는 Peak 들은 Blank 에서도 확인이 되었기에 오염된 peak라고 생각됩니다.
일단 column은 새것이기에 오염여부는 제외하였고,
LC 가 오염이 된듯하여 wash를 하였습니다.
그러다가 부득이하게 기기(메이커만 다른 HPLC)를 바꾸어서 분석을 하게 되어서,
wash 를 한 LC 에서 뒤에나오는 peak들이 제거가 되었는지 아닌지를 확인 못하고
바뀐 LC 에서 분석을 하였습니다
그런데 두번째 기기에서도 첨부한 data 와 패턴이 일치합니다.
기기 오염이었다면 두번째 기기에서도 같은 패턴으로 나온다는게 이해가 잘되지 않아서
두번째 기기도 wash는 하고있으나,
원인이 애매하여 이렇게 도움을 구하고자 글을 올립니다.
많은 답변 부탁드리겠습니다.감사합니다.
- HPLC data
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
이상후님의 답변
2011-07-22- 2
-------------------------------------질문-------------------------------------
첨부한 파일은 HPLC 분석 data 입니다.
이동상A - 500mmol/l ammonium acetate:water:ACN=1:8:1
이동상B - 500mmol/l ammonium acetate:water:ACN=1:1:8
Gradient Time 0 15 40 50 50.1 60
%B 15 15 100 100 15 15
LC 조건은 위와 같은데요.
제가 원하는 peak는 8. 919min에 나오는 peak 이고,
36min~50min 사이에 나오는 Peak 들은 Blank 에서도 확인이 되었기에 오염된 peak라고 생각됩니다.
일단 column은 새것이기에 오염여부는 제외하였고,
LC 가 오염이 된듯하여 wash를 하였습니다.
그러다가 부득이하게 기기(메이커만 다른 HPLC)를 바꾸어서 분석을 하게 되어서,
wash 를 한 LC 에서 뒤에나오는 peak들이 제거가 되었는지 아닌지를 확인 못하고
바뀐 LC 에서 분석을 하였습니다
그런데 두번째 기기에서도 첨부한 data 와 패턴이 일치합니다.
기기 오염이었다면 두번째 기기에서도 같은 패턴으로 나온다는게 이해가 잘되지 않아서
두번째 기기도 wash는 하고있으나,
원인이 애매하여 이렇게 도움을 구하고자 글을 올립니다.
많은 답변 부탁드리겠습니다.감사합니다.
HPLC를 사용중에 Gradient method를 사용하여 분석하게 되면 빈번히 관찰되는 현상으로 보여집니다. 사용하신 gradient가 40분으로 갈수록 이동상 B의 %가 증가되는데 결국 ACN 비율이 커지면서 unknown peak이 나타나는 것으로 판단되는데, ACN만을 injection해서 분석해 보시길...
이상후(sprout30) 2011-07-22ACN 문제가 아닌거 같군요..
종종 gradient를 하게 되면 급격하게 이동상의 비율이 바뀌게 되는 시점부터 baseline도 올라가면서 unknown peak이 나타나는 경우가 종종 있습니다. 만약 실험 조건에서 15분에서 40분 사이에 한 step을 더 첨가해도 된다면 이동상 B를 15%에서 100%로 급격하게 주지 말고 15% -- 40% -- 100% 이런 식으로 해 보시길..현재로서는 gradient 단계로 문제가 좁혀지는 거 같습니다만/... -
답변
조윤환님의 답변
2011-07-22- 0
전체적인 상황을 고려할 때 이런 경우 원인은 이동상 입니다.
검출 파장이 단파장 영역이고, gradient operation을 했고, blank run에서도 동일한 baseline 후반부 패턴이 관찰된 점을 미루어 볼때 기기나 컬럼의 오염은 아니라고 판단됩니다.
이 경우 원인으로는 이동상 제조시 사용한 용기, 완충액 제조시 사용한 시약 및 물 그리고 유기용매(ACN이 되겠죠) 등에 오염이 있는 경우 입니다.
다른 분석에 사용했을 때 문제가 없었던 것이라도 분석방법에 따라 이러한 현상이 나타나기도 하기 때문에 하나하나 점검하셔야 합니다.
점검법을 예를 들자면 100% water로 30분가량 세척한 다음 blank gradient run을 하시고..... 5~10분 가량 equilibration time을 준 다음 blank gradient run 반복하면서 후반부 피크의 강도를 관찰하는 것입니다.
blank gradient run에서 관찰되는 후반부 피크의 강도가 별반 차이가 나타나지 않는다면 유기용매가 범인이고요.......만약 첫번째 blank gradient run의 후반부 피크 강도가 그 뒤에 반복한 run보다 훨씬 강하게 관찰되면 물이 원인인겁니다.
버퍼 제조시 사용한 시약의 문제 여부는 NH4Ac를 들어 있지 않은 동일 조성의 이동상으로 blank gradient run을 반복해보면 확인 할 수 있습니다.
HPLC의 압력이 올라갈 때 검출기에서 인젝터 쪽으로 componet를 하나씩 제거하면서 막힌 곳을 찾아내는 방법과 같은 이치라고 생각하시면 되겠습니다.
이와 같은 문제점은 HPLC method development과정에서 흔히 경험하게 되는 것이기 때문에 관련 textbook을 찾아 보시면 대부분 원인과 해결책에 대해 언급되어 있습니다. 제 개인적으로는 Lloyd Snyder의 책을 권해드리고 싶네요.
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첨부한 파일은 HPLC 분석 data 입니다.
이동상A - 500mmol/l ammonium acetate:water:ACN=1:8:1
이동상B - 500mmol/l ammonium acetate:water:ACN=1:1:8
Gradient Time 0 15 40 50 50.1 60
%B 15 15 100 100 15 15
LC 조건은 위와 같은데요.
제가 원하는 peak는 8. 919min에 나오는 peak 이고,
36min~50min 사이에 나오는 Peak 들은 Blank 에서도 확인이 되었기에 오염된 peak라고 생각됩니다.
일단 column은 새것이기에 오염여부는 제외하였고,
LC 가 오염이 된듯하여 wash를 하였습니다.
그러다가 부득이하게 기기(메이커만 다른 HPLC)를 바꾸어서 분석을 하게 되어서,
wash 를 한 LC 에서 뒤에나오는 peak들이 제거가 되었는지 아닌지를 확인 못하고
바뀐 LC 에서 분석을 하였습니다
그런데 두번째 기기에서도 첨부한 data 와 패턴이 일치합니다.
기기 오염이었다면 두번째 기기에서도 같은 패턴으로 나온다는게 이해가 잘되지 않아서
두번째 기기도 wash는 하고있으나,
원인이 애매하여 이렇게 도움을 구하고자 글을 올립니다.
많은 답변 부탁드리겠습니다.감사합니다.
Blank test 하면서 ACN도 분석해봤는데 36min~50min 까지나오는 패턴이 일치합니다,