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안녕하세요
저는 지금 gram(+) cell에서 genomic DNA를 뽑고있습니다.
실험 방법은 아래와 같습니다.
[A 10-ml portion of overnight bacterial growth in BHI was centrifuged at 11,700 x g for 10 min, washed in 5 ml of 0.1 x SSC (1 x SSC is 0.15M NaCl, 0.015 M sodium citrate), suspended in 1 ml of 0.01M sodium phosphate buffer in 20% sucrose (pH 7.0) with lysozyme (2.5 mg/ml), and incubated 45 min at 37°C. A 9-ml portion of lysis buffer (10 mM Tris-hydrochloride [pH 8.0], 1mM EDTA, 500 ,ug of pronase B per ml [Calbiochem, La Jolla, Calif.], 1% sodium dodecyl sulfate) was then added. After an additional 30 min at 37°C, the samples were
deproteinized by extraction with phenol and chloroform, and the nucleic acids were precipitated with ethanol. The samples were suspended in 10 mM Tris-hydrochloride (pH 8.0)-1 mM EDTA and stored at 4°C.]
위이 실험에서는 pronase B를 사용하였지만 저는 protease K 를 사용하였구요 (농도도 좀 연하게 했습니다.)
그리고 washing 과정 생략했구요 ;;
그리고 phenol-chroloform 처리 과정엔 PCI를 사용했구요 ;
그런데 PCI를 사용해서 정제할때 원심분리를 돌리고 나면 phenol과 상층액 사이에 하얀 물질이 있는데, 보통은 단백질이라서 phenol이 잡고있는 상태인데, 이 하얀물질은 파이펫으로 상층액을 딸때 올라오더라구요
조심조심 하게 한다고 해도 슈슈슉 빨려 올라오고 ;;
그리고 다운도 잘 안되는것 같습니다.
원심분리를 10,000 pm, 20 min동안 하는데 가끔 부유하고 있는 물질이 보이기도 하거든요 ;;
혹시 저와 같은 현상을 격다 해결하신 분 안계신가요?;;
이 하얀 물질이 불순물 인건 알겠는데 ;; PCI처리로는 없앨수 가 없더라구요 ;;
어떻해야 할까요 ?ㅠㅠ
아니면 gram(+) cell로 부터 genomic DNA를 뽑는 다른 좋은 방법 아시면 좀 알려주세요 ㅠ
감사합니다.
- gram(+) cell
- DNA extraction
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