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안녕하세요...도움을 청하고자합니다~~
혹시 Glycoprotein을 PNgase F처리를 하여 deglycoprotein 시켜 Maldi 로 분석하는 방법을 알고싶습니
다.(우선 저는 시료가 아닌 AGP,Fetuin 로 실험하고있습니다.)
지금 제가 하고있는것은 Et-OH로 침천시켜서 하고있는데,deglycoprotein을 Maldi로 기기를 찍으니 잘
나오질않아서요...
혹시 아신다면 Method를 받을수 없을까요?~~~~
- glycan
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
김재훈님의 답변
2011-08-30- 0
생물학연구정보센터 (BRIC) 실험 QnA에 관련 질문이 있어 알려드립니다.
참고하시기 바랍니다.
What is 코너 담당자 김재훈 드림.
-------------------------------------질문-------------------------------------
안녕하세요...도움을 청하고자합니다~~
혹시 Glycoprotein을 PNgase F처리를 하여 deglycoprotein 시켜 Maldi 로 분석하는 방법을 알고싶습니
다.(우선 저는 시료가 아닌 AGP,Fetuin 로 실험하고있습니다.)
지금 제가 하고있는것은 Et-OH로 침천시켜서 하고있는데,deglycoprotein을 Maldi로 기기를 찍으니 잘
나오질않아서요...
혹시 아신다면 Method를 받을수 없을까요?~~~~
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답변
이상후님의 답변
2011-08-31- 0
첨부파일
-------------------------------------질문-------------------------------------
안녕하세요...도움을 청하고자합니다~~
혹시 Glycoprotein을 PNgase F처리를 하여 deglycoprotein 시켜 Maldi 로 분석하는 방법을 알고싶습니
다.(우선 저는 시료가 아닌 AGP,Fetuin 로 실험하고있습니다.)
지금 제가 하고있는것은 Et-OH로 침천시켜서 하고있는데,deglycoprotein을 Maldi로 기기를 찍으니 잘
나오질않아서요...
혹시 아신다면 Method를 받을수 없을까요?~~~~
최근 자료가 있어서 첨부 합니다. 참고하세요..
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답변
황인성님의 답변
2011-09-08- 0
우선 '잘 나오지 않는다'는 말씀이 전체적인 MALDI peak이 안 나온다는 것으로 전제하겠습니다.
MALDI peak이 잘 나오지 않는 이유는 수백만 가지가 있지만 대개는 sample의 문제입니다.
너무 많지도 않고 적지도 않은 농도가 필요하고 (주로 수십~수백 pmoles/ul), 각 시료의 분자량에 따라 적당한 matrix를 써야합니다(처음엔 SA, CHCA, DHB 모두 시도). 적절한 단백질 농도와 matrix의 배합에 따라 고르게 결정이 생기면서 빠른 시간에 마른다면 대개 잘 나옵니다.
EtOH 침전은 다시 잘 녹아 나오기만 한다면 MALDI sampling으로 지장 없겠지만 이 역시 농도와 종류에 따라 적은 양의 용액에 다시 녹아나오지 않는 경우가 빈번히 있으므로 추천하는 방법은 아닙니다.
시료의 농축은 수용액에서 반응시켰다는 전제라면, 주로 zip-tip을 이용하면 됩니다. (이건 주로 분석센터에서 제공합니다.) zip-tip은 MALDI의 가장 큰 적인 NaCl 등의 salt를 제거해주기도 합니다.
드물게는 freeze-dry를 하기도 합니다만 이 경우는 시료가 많을 경우입니다. 같이 말리는 방법이라도 Speedvac은 절대로 해서는 안 됩니다.
정리하자면,
1. Deglycosylation 반응을 시킵니다.
2. 10~20 ul 정도를 바로 Zip-tip에 loading합니다.
3. 10~20 ul의 0.1% TFA/water로 씻어냅니다.
4. 원하는 matrix가 녹아 있는 50% AcCN/0.1%TFA/water 5 ul로 elution 하면서 plate에 2~3개 정도의 spot으로 나눠 loading 합니다.
5. 건조한 대기에서 말리고 분석을 시도합니다. 사용한 enzyme의 양에 따라 enzyme peak도 나올 수 있으므로 분자량을 미리 잘 알아두어야겠죠?
6. Peak이 잘 안 나오거나 너무 작으면 1, 2번에서 양을 조절합니다.
이런 류의 일은 약간의 인내심과, 한 번에 된다는 기대보다는 될 때까지 한다는 마음자세가 필요합니다. ^^
그럼, 행운을 빕니다.
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혹시 Glycoprotein을 PNgase F처리를 하여 deglycoprotein 시켜 Maldi 로 분석하는 방법을 알고싶습니
다.(우선 저는 시료가 아닌 AGP,Fetuin 로 실험하고있습니다.)
지금 제가 하고있는것은 Et-OH로 침천시켜서 하고있는데,deglycoprotein을 Maldi로 기기를 찍으니 잘
나오질않아서요...
혹시 아신다면 Method를 받을수 없을까요?~~~~