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지금 Prep HPLC 분석을 하고 있습니다,
처음에 0min~40min까지 gradient 를 걸어서 16min 에 제가 원하는 peak 를 확인했습니다.
그런데 impurity 들이 양쪽으로 1min 도 차이가 안나서 좀 늘려볼까해서
gradient %는 그냥둔채로 0~50min 으로 시간만 늘였습니다.
그런데 아예 impurity 도 product 도 나오질 않았습니다.
그래서 빼려고 100% 유기용매로 밀었는데 역시 나오지 않네요,
근본적으로 column 을 제가 이해를 잘못한거 같아서
이렇게 injection 했음에도 peak 이 나오지 않는 이유가 궁금합니다.
부탁드리겠습니다.
- Prep HPLC
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
황인성님의 답변
2011-09-02- 3
100% 유기용매로 밀었다면 peak을 보기 힘들 수도 있습니다. Injection peak이나 압력 노이즈에 뭍혀 나왔을 수도 있고 어떤 경우엔 전체적으로 질질 새면서 나왔을 수도 있습니다. 그러나 100% 유기용매로는 완벽하게 씻기지 않습니다. 무조건 높은 %에서 elution 되는 게 아니라 특정한 %에서 peptide의 conformation이 변해 고정상과의 affinity가 낮아져서 elution 되는 것입니다. 따라서 컬럼을 씻기 위해서는 0-100-0% gradient를 이용해 여러번 돌려주는 것이 좋습니다.
그리고 난 후 처음과 같은 0~40 min setting으로 반복하는 것이 가장 우선일 듯합니다. 그 다음 씻어주고 0~50 min 시도해보고 하는 식으로. 그래도 전과 같이 0-40 min에선 나오는데 0-50 min에서 안 나온다면 0-40 min으로 계속 하는 것이 정답입니다. 만약 두 번째 0-40 min에서도 안 나온다면 column clogging을 의심해야 합니다. 압력이 올라갔다면 column을 거꾸로 걸고 씻어 주는 것도 도움이 됩니다.
때로 드물게 ghost peak이 나옵니다. 여러 번 같은 gradient 조건으로 injection 없이 running 했을 때 아무것도 없는 것을 확인했다면 상관없겠지만요.
혹시 lamp의 수명이 다 한 건 아니겠지요? ^^;
좋은 결과 있길 바랍니다!
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지금 Prep HPLC 분석을 하고 있습니다,
처음에 0min~40min까지 gradient 를 걸어서 16min 에 제가 원하는 peak 를 확인했습니다.
그런데 impurity 들이 양쪽으로 1min 도 차이가 안나서 좀 늘려볼까해서
gradient %는 그냥둔채로 0~50min 으로 시간만 늘였습니다.
그런데 아예 impurity 도 product 도 나오질 않았습니다.
그래서 빼려고 100% 유기용매로 밀었는데 역시 나오지 않네요,
근본적으로 column 을 제가 이해를 잘못한거 같아서
이렇게 injection 했음에도 peak 이 나오지 않는 이유가 궁금합니다.
부탁드리겠습니다.