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지식나눔

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stemcell 분화와 FACS 에 대한 질문 및 궁금증이 있습니다. 도와주세요! ㅠㅠ

2011-10-06 org.kosen.entty.User@543adbe2 장유진(STELLAR153)
  • 1
안녕하세요, 저는 stemcell 을 분화시켜 그 분화 정도를 FACS 로 분석하고 있습니다

처음 FACS 실험기법을 배울 때 fix 를 하지 않는 것으로 배워
(cell harvest 후 1, 2차 Ab를 따로 incubation 해 준비)
1차 Ab를 제가 보고 싶은 마커로 변경하여 실험을 진행하였는데

실험을 모두 수행한 뒤에 더 공부해 보니까
제가 처리한 1차 Ab 중 하나만 surface antigen 이고
하나는 cytosolic protein, 나머지는 IF 인 거에요;;;
surface antigen 하나 빼고는
intracellular staining 해서 FACS 를 해야 하는 거였더라구요, (초보라 몰랐어요 ㅠㅠ)

이 경우 제 data 를 신뢰할 수 있을까요?;;;

경향성은 Real time PCR 등과 비슷하게 나왔습니다만;;
아무래도 fix 도 triton x100도 처리하지 않은 점이 마음에 많이 걸려서요..
1,2차 Ab를 모두 높은 dilution 으로 처리했기 때문에
반응이 일어나지 않았다고 말하긴 또 어렵겠지만 (1:20)...

아, 그리고 한가지 변수가 더 있는데요,
제가 사용한 2차 Ab는 intracellular staining 용 PE conjugate Ab 입니다.
하지만 단순히 이것을 사용했다고 해서 intracellular staining 이 되었다고 말할 수 있을까요?

FACS data 를 논문에 넣을지 말 지 고민이 많습니다.

전문가분들의 지적과 조언 부탁드립니다 ㅠ_ㅠ 

  • facs
  • intracellular staining
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답변 1
  • 답변

    김윤상님의 답변

    2011-10-06
    • 0
    아시겠지만, intracellular staining 을 위해서는 permeabilization과 fixation 과정이 필요합니다.

    이 과정을 통해 antibodies가 세포막을 통과해서 세포내의 항원에 결합하게 되는 것이죠.

    이런 특별한 처리과정 없이 그냥 일반 surface antigen을 staining하는 방법과 동일하게 하셨다면, 
    실험이 올바르게 되지 않은 것이고, 따라서 그 결과를 신뢰할 수가 없습니다. 
    비록 다른 실험들과 비슷한 경향을 띤다고 하더라도 말이죠.

    어떤 실험이든지 처음 하실 때에는, 경험 많은 실험실 선배나 지도교수님의 검토를 받아야 하는 게 옳은데, 그럴 상황이 되지 못한 것 같군요. 안타깝습니다.
    답변수정
    아시겠지만, intracellular staining 을 위해서는 permeabilization과 fixation 과정이 필요합니다.

    이 과정을 통해 antibodies가 세포막을 통과해서 세포내의 항원에 결합하게 되는 것이죠.

    이런 특별한 처리과정 없이 그냥 일반 surface antigen을 staining하는 방법과 동일하게 하셨다면, 
    실험이 올바르게 되지 않은 것이고, 따라서 그 결과를 신뢰할 수가 없습니다. 
    비록 다른 실험들과 비슷한 경향을 띤다고 하더라도 말이죠.

    어떤 실험이든지 처음 하실 때에는, 경험 많은 실험실 선배나 지도교수님의 검토를 받아야 하는 게 옳은데, 그럴 상황이 되지 못한 것 같군요. 안타깝습니다.
    장유진(STELLAR153) 2011-10-06

    많은 도움이 되었습니다... 빠른 답변 감사드립니다.
    며칠을 고민했는데..역시 빼야 할 거 같네요.... 감사합니다 :)

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