- 1
안녕하세요!!
대학원에 진학중인 학생입니다.
제가 궁금한 것은 mRNA level과 protein level이 차이가 나는 이유입니다.
저희가 특정 단백질의 발현 유무를 확인하고 있는데요 .
mRNA의 경우 reverse transcription PCR을 이용하고, protein의 경우 western을 이용하여
발현 수준을 확인하고 있습니다.그런데 PCR 결과에서는 거의 발현하지 않는 것처럼 나오는데,
western으로 확인하면 control에 비해서 양이 굉장히 증가되어 있습니다. 이러한 이유가 무엇인지 궁금합니다. ㅠ
한가지 더 궁금한게 있습니다.
위와 동일한 단백질을 확인하기 위해서 동일한 샘플을 반씩 나누어서 IF,western으로 확인하였는데요. western상에서는 증가된 패턴을 확인하였지만, IF에서는 변화가 없는 것처럼 확인되었습니다. IF를 할때는 이 단백질에 대한 Positive cotrol을 사용하여 staining상에서는 문제가 없음을 확인하였습니다. western,IF사용한 antibody는 동일한 제품입니다.
너무 번잡스럽게 써놨는데, ㅠ답변부탁드리겠습니다.
- 생명과학
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
-
답변
황인성님의 답변
2011-10-19- 3
mRNA 양과 발현양은 반드시 비례하는 것이 아닙니다. 학생의 실험 조건에서 mRNA로부터 단백질이 발현되기 위해서 필요한 수많은 조건이 동일하지 않다는 말입니다. 흔한 현상입니다.
먼저 RT-PCR이 정량이 가능한 real time pcr인지 확인해 보시고, 계속 결과가 그렇다면 그 결과를 믿어야지요.
Western 검출은 신호를 축적하는 방식입니다. 때문에 western에서는 미미한 차이가 극대화 되는 (역)효과가 있습니다. 검출 한계도 IF보다 낮으므로 어중간한 신호는 검출 문턱을 넘지 못하지만 문턱만 넘으면 시간에 따라 차이가 확 나게 됩니다. IF는 형광신호가 실시간으로 refresh되므로 축적되지 않습니다. 단순히 exposure time을 조절해서 신호의 강약을 조절할 뿐이죠. 따라서 형광이 밝을 때는 차이를 보기 위해 exposure time를 더 줄여야 할 때가 많습니다.
-------------------------------------질문-------------------------------------
안녕하세요!!
대학원에 진학중인 학생입니다.
제가 궁금한 것은 mRNA level과 protein level이 차이가 나는 이유입니다.
저희가 특정 단백질의 발현 유무를 확인하고 있는데요 .
mRNA의 경우 reverse transcription PCR을 이용하고, protein의 경우 western을 이용하여
발현 수준을 확인하고 있습니다.그런데 PCR 결과에서는 거의 발현하지 않는 것처럼 나오는데,
western으로 확인하면 control에 비해서 양이 굉장히 증가되어 있습니다. 이러한 이유가 무엇인지 궁금합니다. ㅠ
한가지 더 궁금한게 있습니다.
위와 동일한 단백질을 확인하기 위해서 동일한 샘플을 반씩 나누어서 IF,western으로 확인하였는데요. western상에서는 증가된 패턴을 확인하였지만, IF에서는 변화가 없는 것처럼 확인되었습니다. IF를 할때는 이 단백질에 대한 Positive cotrol을 사용하여 staining상에서는 문제가 없음을 확인하였습니다. western,IF사용한 antibody는 동일한 제품입니다.
너무 번잡스럽게 써놨는데, ㅠ답변부탁드리겠습니다.