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RIPA buffer를 사용하여 cell lysis하는데요.
예전에는 안그랬는데 요즘 cell lysis하기 위하여 RIPA buffer를 처리하면
cell pellet이 콧물처럼 끈적이고,
나중에 supernatant를 딸 때 콧물같은 cell pellet이 자꾸 딸려 올라옵니다.
cell 양이 많은 것도 아니고, 오히려 적습니다.
예전에는 RIPA로 잘 뽑히던 protocol이었는데
콧물 끈적거림 현상이 계속되고 있어서 아까운 sample만 버리고 있답니다.ㅠ
다른 분들 말로는 cell이 많아서 그렇다 , genomic DNA가 많아서 그렇다고 하시는데,
cell도 많지 않고, 이에 따라서 genomic DNA도 많이 나오지 않을 것이라 예상하고 있습니다.
고수님들, 이 현상을 치유하기 위해선 어찌해야하는 것일까요?
아래 저희 실험실에서 만다는 RIPA buffer 조성 파일을 함께 올립니다.ㅠㅠ
도와주세요~!
- western blot
- protein extraction
- 끈적거림 현상
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
표재훈님의 답변
2012-01-11- 2
-------------------------------------질문-------------------------------------
RIPA buffer를 사용하여 cell lysis하는데요.
예전에는 안그랬는데 요즘 cell lysis하기 위하여 RIPA buffer를 처리하면
cell pellet이 콧물처럼 끈적이고,
나중에 supernatant를 딸 때 콧물같은 cell pellet이 자꾸 딸려 올라옵니다.
cell 양이 많은 것도 아니고, 오히려 적습니다.
예전에는 RIPA로 잘 뽑히던 protocol이었는데
콧물 끈적거림 현상이 계속되고 있어서 아까운 sample만 버리고 있답니다.ㅠ
다른 분들 말로는 cell이 많아서 그렇다 , genomic DNA가 많아서 그렇다고 하시는데,
cell도 많지 않고, 이에 따라서 genomic DNA도 많이 나오지 않을 것이라 예상하고 있습니다.
고수님들, 이 현상을 치유하기 위해선 어찌해야하는 것일까요?
아래 저희 실험실에서 만다는 RIPA buffer 조성 파일을 함께 올립니다.ㅠㅠ
도와주세요~!
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RIPA는 핵까지 녹이는 harsh한 조성이므로 끈적임이 생기는게 당연합니다.
오히려 끈적임이 생기지 않는게 이상한거죠.
1ml짜리 needle을 꽂은 syringe로 10-30회 통과를 시키거나
sonication을 10초 정도 약하게 해서 chromosomal DNA를 망가뜨려주면 끈적임이 없어집니다.
gel에 걸었을때도 smearing 없이 깨끗하게 나오구요
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답변
최수미님의 답변
2012-01-12- 2
RIPA buffer조성은 보았는데, 반응 시간이나 centrifugation speed는 안나왔네요.
반응 시간이 너무 긴 경우에도 그런 현상이 나타납니다.
특정한 cell type이 그런 경우도 있구요, 제 경우 HepG2에서 그런 현상이 있었습니다. 유난히 많은 volume의 RIPA를 필요로 하는 cell line이 있습니다.
sonication도 좋은 방법이지만, centrifugation을 두번 진행하시는 것도 좋을 것 같습니다.
-------------------------------------질문-------------------------------------
RIPA buffer를 사용하여 cell lysis하는데요.
예전에는 안그랬는데 요즘 cell lysis하기 위하여 RIPA buffer를 처리하면
cell pellet이 콧물처럼 끈적이고,
나중에 supernatant를 딸 때 콧물같은 cell pellet이 자꾸 딸려 올라옵니다.
cell 양이 많은 것도 아니고, 오히려 적습니다.
예전에는 RIPA로 잘 뽑히던 protocol이었는데
콧물 끈적거림 현상이 계속되고 있어서 아까운 sample만 버리고 있답니다.ㅠ
다른 분들 말로는 cell이 많아서 그렇다 , genomic DNA가 많아서 그렇다고 하시는데,
cell도 많지 않고, 이에 따라서 genomic DNA도 많이 나오지 않을 것이라 예상하고 있습니다.
고수님들, 이 현상을 치유하기 위해선 어찌해야하는 것일까요?
아래 저희 실험실에서 만다는 RIPA buffer 조성 파일을 함께 올립니다.ㅠㅠ
도와주세요~!
이효지(koko7912) 2012-01-12반응시간은 10분에 한번씩 vortexing, 4 times하고, 14000RPM으로 30min 돌려서 상층액을 땁니다. 상층액 딸 때, 아래에 존재하는 cell pellet 자체가 콧물처럼 딸려올라오는 증상입니다.ㅠㅠ centrifugation 두 번 했는데도 나아지지가 않아요ㅠㅠㅠㅠㅠ
RIPA 사용 시 끈적임이 약간 있다는 것은 알지만, 저희가 일전에 사용했던 RIPA보다 현재 사용하고 있는 RIPA에서 끈적임이 심해졌다는 뜻입니다. 아예 RIPA buffer로 cell lysis한 후, centrifuge를 돌린 다음 상층액을 딸 때 아래에 존재하는 pellet 자체가 콧물처럼 끈적여서 상층액 따기가 힘들어졌습니다. RIPA 조성물에 문제가 생긴건 아닐까요?