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A라는 시약 처리에대한 세포의 성장을 알아보기 위해 MTT assay를 설계하고 있습니다.
제가 설계한 방법입니다.
1. Seeding (in 96 well plate)
(1) Cell 을 Hemocytometer 를 사용하여 counting
(2) 96 well plate 의 각 well 에 5×103 cells 를 넣는다.
(3) 각 well 당 total 200㎕ 가 되도록 배지를 채워준다.
2. Incubation
3. 24h 후, 배지교환 및 측정하고자 하는 시료를 농도별로 각 well 에 첨가
4. 24h 후, MTT sol. 처리
(1) 배지를 버리지 않고, 희석한 MTT sol.(2mg/ml) 50㎕ 을 각 well에 처리
(2) MTT sol. 은 빛에 민감하므로 clean bench 불을 끄고 실험한다.
(3) CO2 incubate 에서 2 시간 동안 둔다.
5. DMSO 처리
(1) MTT solution 을 제거하고 DMSO(실온보관)를 50㎕ 넣는다.
(2) DMSO 는 빛에 민감하므로 clean bench 불을 끄고 실험한다.
(3) 호일에 plate 를 싸서 5~10분 정도 방치 후 590nm에서 흡광도 측정
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Q1. blank 와 control은 어떻게 해야 하난요>?
control을 시약을 처리하지 않은 cell 부유액이라면 blank는?
Q2. 인터넷을 검색해보니 background(reference) data가 필요하다는데 background(reference) data가 무엇이고, 어떻게 해야 하는지요
Q3. A라는 시약에 대한 3일 후 cell 성장을 측정하나고 가정한다면,
매일 배지를 갈아주고 A라는 시약을 처리해야하는지..아니면 A라는 시약을 처리하고 3일 후에 측정만 하면 되는지...궁굼합니다.
- MTT
- 세포
- cell
각 분야 한인연구자와 현업 전문가분들의 답변을 기다립니다.
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답변
최병현님의 답변
2012-02-14- 0
아래 질문별로 답변 바로 붙입니다.
-------------------------------------질문-------------------------------------
A라는 시약 처리에대한 세포의 성장을 알아보기 위해 MTT assay를 설계하고 있습니다.
제가 설계한 방법입니다.
1. Seeding (in 96 well plate)
(1) Cell 을 Hemocytometer 를 사용하여 counting
(2) 96 well plate 의 각 well 에 5×103 cells 를 넣는다.
(3) 각 well 당 total 200㎕ 가 되도록 배지를 채워준다.
2. Incubation
3. 24h 후, 배지교환 및 측정하고자 하는 시료를 농도별로 각 well 에 첨가
4. 24h 후, MTT sol. 처리
(1) 배지를 버리지 않고, 희석한 MTT sol.(2mg/ml) 50㎕ 을 각 well에 처리
(2) MTT sol. 은 빛에 민감하므로 clean bench 불을 끄고 실험한다.
(3) CO2 incubate 에서 2 시간 동안 둔다.
5. DMSO 처리
(1) MTT solution 을 제거하고 DMSO(실온보관)를 50㎕ 넣는다.
(2) DMSO 는 빛에 민감하므로 clean bench 불을 끄고 실험한다.
(3) 호일에 plate 를 싸서 5~10분 정도 방치 후 590nm에서 흡광도 측정
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Q1. blank 와 control은 어떻게 해야 하난요>?
control을 시약을 처리하지 않은 cell 부유액이라면 blank는?
>> 일반적으로 blank는 아무 것도 들어있지 않은 시료.. 예를 들면, PBS 또는 배지만 들어 있는 시료를 말합니다. 이러한 blank에도 MTT 시약을 처리하고 같이 assay를 하시기 바랍니다. 이것이 아래에서 얘기하는 'background data'가 됩니다.
Q2. 인터넷을 검색해보니 background(reference) data가 필요하다는데 background(reference) data가 무엇이고, 어떻게 해야 하는지요
>> Q1에서 얘기한 대로 blank에 MTT 시약을 넣고 측정한 값을 background data로 하여.. 다른 시료들의 값에서 이 값을 빼 주고.. 이렇게 하여 나온 값에 대해 상호 비교를 하면 됩니다.
예를 들어. A를 처리하지 않은 대조군과 처리한 실험군의 결과를 비교하고자 한다면...
- 시료는 Blank, 대조군, 실험군의 3개를 준비합니다.
- 각 시료에 대해 MTT assay를 수행하여 나온 값은 B, C, E라고 한다면...
- 결과 처리는 (C-B)와 (E-B)를 비교 합니다.
- 상대적인 fold를 원한다면.. (E-B)/(C-B)를 구합니다.
Q3. A라는 시약에 대한 3일 후 cell 성장을 측정하나고 가정한다면,
매일 배지를 갈아주고 A라는 시약을 처리해야하는지..아니면 A라는 시약을 처리하고 3일 후에 측정만 하면 되는지...궁굼합니다.
>> A를 매일 다시 처리해야 하는지.. 아니면 1회 처리하고 3일 후에 분석하면 되는지? 에 대한 질문인 것 같은데..
정확한 답변은 'case by case'이다 입니다. 즉, 실험의 목적과 종류에 따라 달라집니다.
하지만... 일반적인 상황을 생각하면.. A의 기능과 half-life을 고려해서 결정하면 됩니다.
예를 들면..
- A가 growth factor/cytokine 이라면..배지에서의 half-life이 아주 길지는 않습니다. 이 경우 일반적으로 2일에 한번씩 배지를 교환하면서 A도 다시 넣어 주면 됩니다. 그런데.. 목적하는 time point가 3일이면 더 넣어 줄지 말지 약간 고민스럽네요.
- A가 세포의 성장을 억제하거나 죽이는 기능을 한다면..A의 half-life과 함께 농도도 고민해야 합니다. 농도가 충분히 높아서 초기 효과가 강하다면.. 3일 이상의 장기간에서 세포의 증식 억제 또는 사멸 효과가 지속될 수있습니다. 이 경우 half-life에 관계 없이 1회만 처리해도 원하는 효과가 나타날 수 있습니다.
결론적으로..
- 3일 정도면 우선 1회만 처리하고 3일 후에 assay를 해보기를 권합니다. 실험의 결과에 따라 time point와 처리 회수 등 전체 실험의 디자인에 대해 한꺼번에 고민하는 것이 좋을 것 같습니다. .